表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的重组马立克氏病病毒的构建

传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是一种由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的危害3～12周龄青年鸡的急性、高度接触性传染病.IBDV属于双RNA病毒科的禽双RNA病毒属,其基因组由A和B两个节段组成.研究表明,IBDV主要的抗原性及致病性位点均位于A片段,其中VP2蛋白具有血清型特异性位点,并能诱导产生抗病毒的血清中和抗体,是该病毒的主要抗原.     

SUMO融合系统高效表达可溶性IBDV NB株VP2S-P域蛋白

鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)导致机体出现免疫抑制。VP2是IBDV主要保护性抗原表位的结构蛋白,Shell域和Projection域位于IBDV VP2蛋白的胞外区和跨膜区,包含VP2主要的抗原位点。前期研究在Shell域筛选到能够与IBDV多抗结合的多肽。因此,本研究利用PCR扩增Shell域和Projection域的基因,添加小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)作为标签,构建SUMO系统高效表达系统,诱导表达获得VP2 Shell域和Projection域的可溶性融合蛋白,命名为SUMOVP2-S-P。SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,出现与预期蛋白大小相符合的可疑条带;Western blotting鉴定结果显示,SUMO-VP2-S-P重组蛋白能够与His单抗特异性结合。初步结果表明,SUMO-VP2-S-P重组蛋白为我们需要的目的蛋白,为后期蛋白纯化建立IBDV抗体快速检测方法提供材料基础。     

MDV-1 VP22羧基端在大肠杆菌中高效可溶性表达

VP22是血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的复制和传播必不可少的组分。本研究从MDV-1无致病性的CVI988/Rispens疫苗感染的鸡胚成纤维细胞DNA中扩增得到VP22基因,并在大肠杆菌中表达其C端功能区。SDS-PAGE电泳发现,VP22C端得到高效可溶性表达,大小为42kDa左右。将获得的阳性条带经切胶免疫和细菌超声波裂解的上清作为抗原免疫6周龄Balb/C小鼠,均能诱导产生特异性抗VP22C端抗体。通过免疫荧光试验,检测到VP22在感染MDVCEF所有细胞核中呈特异性表达。这一抗体对深入研究VP22蛋白转导功能起到重要的作用。     

禽IL-2与传染性法氏囊VP2融合蛋白免疫学特性

为研究禽细胞因子IL-2与IBDV主要保护性抗原VP2基因融合蛋白的免疫学特性,将重组的rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡,通过IBDV-VP2 ELISA抗体效价、抗体亚型(IgG1和IgG2a)、淋巴细胞增殖、INF-γ和IL-4细胞因子的分泌水平、中和抗体以及动物攻毒试验检测评价其对鸡体免疫水平的影响。抗体滴度测定和淋巴细胞增殖试验结果显示,rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡体的体液和细胞免疫应答水平均明显高于单独的VP2蛋白免疫组。抗体亚型测定结果显示,rVP2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。细胞因子ELISA试验结果表明rVP2-IL-2融合蛋白能有效平衡Th1(γ-IFN)和Th2(IL-4)类型的细胞免疫反应。动物攻毒试验rVp2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体获得了85%的保护率,表明构建的rVP2-IL-2融合蛋白对IBDV的攻击具有较好的免疫保护作用。本研究为进一步研制IBD高效的基因工程疫苗奠定了基础。     

MDV-1 VP22羧基端在大肠杆菌中高效可溶性表达

VP22是血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV-1)的复制和传播必不可少的组分.本研究从MDV-1无致病性的CVI988/Rispens疫苗感染的鸡胚成纤维细胞DNA中扩增得到VP22基因,并在大肠杆菌中表达其C端功能区.SDS-PAGE电泳发现,VP22 C端得到高效可溶性表达,大小为42kDa左右.将获得的阳性条带经切胶免疫和细菌超声波裂解的上清作为抗原免疫6周龄Balb/C小鼠,均能诱导产生特异性抗VP22 C端抗体.通过免疫荧光试验,检测到VP22在感染MDV CEF所有细胞核中呈特异性表达.这一抗体对深入研究VP22蛋白转导功能起到重要的作用.     

含禽流感病毒M2e 氨基端抗原表位的重组传染性法氏囊病毒VP2 蛋白的免疫原性鉴定

【目的】构建传染性法氏囊病毒VP2蛋白展示禽流感M2e抗原表位的重组蛋白,研发预防H5或H9亚型禽流感和传染性法氏囊的基因工程疫苗。【方法】根据现有禽流感疫苗株M2e的氨基端12个氨基酸多肽序列(nM2e)序列,结合GenBank中H5和H9亚型禽流感病毒nM2e的比对结果,确定nM2e序列。用融合PCR分别将1拷贝H5或H9的nM2e序列插入IBD B87株VP2基因的PBC区,获得VP2BCnM2e重组基因。将重组基因克隆至杆状病毒表达系统,转染Sf9细胞进行表达。经间接免疫荧光和Western blotting检测Sf9细胞表达重组基因后,扩繁重组病毒,制备疫苗,间隔4周对非免鸡作2次重复免疫,用间接ELISA和鸡胚成纤维细胞中的病毒血清中和试验检测血清中VP2和nM2e的抗体效价。【结果】成功构建含H5或H9 nM2e的VP2BCnM2e重组基因,该重组基因在Sf9细胞中得到表达。经免疫鸡,两重组蛋白均能激发针对VP2和nM2e的抗体,VP2BCnM2eH5组抗体效价高于VP2BCnM2eH9组。【结论】两重组蛋白均具有免疫原性,VP2BCnM2eH5免疫原性更佳。     

MDV-1 VP22增强鸡传染性法氏囊炎病毒VP2 DNA免疫作用

马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）被膜成分中的VP22具有蛋白转导功能．将鸡传染性法氏囊炎病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2与MDV—VP22同时插入pcDNA3．1构建融合蛋白表达载体,在COS-1细胞中进行暂态表达．结果表明：VP22并不能促进VP2向周围未转染细胞转导,即VP22对VP2没有明显的蛋白转导作用,相反,VP2影响VP22在细胞内的正常定位．然而,通过小鼠股四头肌免疫注射PEI包裹的裸质粒DNA进行DNA免疫,以间接ELISA测定VP2抗体效价,FACS检测T细胞亚类．发现,虽然VP22没有明显促进VP2的体液免疫应答,但脾脏淋巴细胞分群结果表明,VP22-VP2融合蛋白表达载体免疫组和VP2质粒免疫组的CD3^＋T细胞数量显著高于eGFP-VP2组和对照组（P〈0．05）,融合蛋白表达载体免疫组小鼠CD8^＋／CD4^＋T细胞的比例与VP2质粒免疫组相比,明显增强（P〈0．05）,与对照组相比差异极显著（P〈0．01）．这表明VP22对VP2的特异性细胞免疫反应具有一定增强作用．     

表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体.首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV-VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX△E3VP2.用Sal I+Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2.Cla I+Asc I酶切pCAV-2-FPV-VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2.该重组病毒能使MDCK细胞产生腺病毒样细胞病变.Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白.该重组病毒可以有效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体.本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株.     

鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

传染性法氏囊病病毒 (IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的b肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtA △VP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtA △VP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。     

表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建

将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因（EGFP）串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDV CVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、Dot-blotting,Western-blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1（CVI988）基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIV A/Chicken/Guangdong/00（H9N2）攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。     

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克氏病毒的构建

用聚合酶链式反应(PCR)方法从真核表达载体pcDNA3.1-VP2中扩增出包含CMV和polyA的VP2表达盒基因片段,经琼脂糖凝胶电泳大小为2.4kb;将该基因片段插入马立克氏病病毒(MDV)CVI988//Rispens的非必需区US10片段中,经SphI酶切分析获得大小为6.0和2.4kb两个片段,表明成功构建出表达VP2基因的MDV CVI988转移载体pUC18-US10-VP2质粒.将质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过免疫荧光方法筛选,结果获得了表达VP2基因的重组MDV(rMDV-VP2).用IBDV特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验(IFA)证实,rMDV-VP2病毒传至第8代仍能稳定表达VP2蛋白,这为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.     

重组家蚕病毒表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

将传染性囊病病毒ＨＺ９６株主要宿主保护性抗原ＶＰ２的ｃＤＮＡ基因克隆到杆状病毒转移载体ｐＢａｃ－ＰＡＫ８中,获得重组转移载体ｐＢａｃＰＡＫ－ＶＰ２,载体ｐＢａｃＰＡＫ－ＶＰ２与修饰病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ６线性化基因组ＤＮＡ共转染单层家蚕Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｂｍ）Ｎ细胞,经细胞内同源重组,筛选到重组病毒。ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫鲩迹结果表明,ＶＰ２在家蚕培养细胞和家蚕幼虫中均得到了表达。     

表达LacZ基因的重组CVI988病毒的构建及特性研究

马立克氏病（MD）是一种鸡的淋巴增生性肿瘤疾病,是由马立克氏病病毒血清1型（Marek＇s disease virus serotype 1,MDV1）引起的,但是,可以由致弱的或天然不致病的疫苗株进行防制。疫苗株分为三种类型：致弱的血清1型,天然不致瘤的血清2型（MDV2）和天然不致病的火鸡疱疹病毒（HVT）。     

串联表达马立克氏病病毒糖蛋白B主要抗原决定簇基因的重组鸡痘病毒的构建

马立克氏病(Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的一种具有高度传染性、淋巴组织增生性疾病,病理上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器和皮肤发生单核细胞浸润为特征[1].MD是世界上最重要的家禽传染病之一,是造成世界养禽业重大经济损失的一个主要原因.20世纪70年代早期MD疫苗的发现才使MD得到控制[2].     

表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒的构建及特性

提取马立克氏病毒Ⅰ型疫苗毒株CVI988的总DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒生长非必需的US2基因并克隆入T—easy载体。将CMV启动子和增强子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中,成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP。用脂质体将其与CVI988株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP,并分别测定其在体内和体外的生长情况。表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似,体外实验表明,1日龄腹腔接种该重组毒后,可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒。     

表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免？…

将将城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８株融合蛋白基因导入鸡痘病毒（ＦＰＶ）插入载体ｐＥＧＦ１１７５－１的Ｐ７．５启动子下游,得到转移载体ｐＦＧ１１７５－１重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染ＦＰＶ２８２Ｅ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）。,经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒ｒＦＰＶ－ＮＤＦ。间接免疫荧光试验表明,ｒＦＰＶ－ＮＤＦ感染的ＣＥＦ中表达了ＮＤＶ的融合蛋白。用ｒＦＰＶ－ＮＤＦ免疫的ＳＦ     

表达GFP基因的马立克氏病病毒(MDV)转移载体的构建及初步应用

利用Primer primer 5.0软件设计两条引物,将loxP位点分别引入正、反向引物,以质粒载体pIRES-gpt为模板,扩增获得LoxP-CMV-gpt-IRES-LoxP基因表达盒(约2.9kb),将其克隆入质粒pBUS10 (含有MDV US10区) 的BalⅠ位点,获得重组质粒 pUS-gptIRES(L);对重组质粒pUS-gptIRES(L)进行测序分析,发现两同向的loxP位点正确插入到pUS-gptIRES(L)中;将含有完整的GFP基因以及poly A尾的基因片断,连入pUS-gptIRES(L)中,把gpt基因替换掉,从而获得重组质粒pUS-GFPIRES(L)。将转移载体pUS-GFPIRES(L)瞬时转染CHO细胞,可以观察到绿色荧光,说明GFP基因获得有效表达;将pUS-GFPIRES(L) 转染已感染MDV CVI988株的CEF细胞,可以筛选到表达绿色荧光蛋白的重组病毒;通过测定重组病毒在细胞上的生长曲线,发现重组病毒与亲本毒生长曲线相吻合。本研究为进一步探讨MDV在体内的特性奠定基础,同时,为Cre/LoxP重组酶系统在MDV中的应用奠定基础。