家蚕浓核病毒中国株基因组DNA的分离纯化与鉴定

家蚕浓核病毒中国株的正链DNA和负链DNA分别包裹在不同的病毒粒子中,而且两条链的大小不同,经高盐浓度的DNA抽提缓冲液提取后,在琼脂糖凝胶电泳谱中呈现出大小不同的两条带,一条6．4kb,另一条5．8kb。作者分别用高盐和低盐抽提缓冲液提取了家蚕浓核病毒中国株的基因组DNA,意外发现用低盐抽提缓冲液抽提出来的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳谱中仅呈现一条带。推测可能是由于大小不同且不完全互补的正负链,在低盐缓冲液中形成有效的互补,因而呈现一条6．2kb的条带。     

一种家蚕类浓核病毒的组织病理学特征

本文从家蚕病蚕中分离到一种家蚕类浓核病毒（BmDNV-Like）,对它的组织病理学研究表明:该病毒首先寄生家蚕中肠柱状细胞,继而引起其细胞核的膨大和破裂;组织原位杂交结果表明该病毒既能在家蚕中肠柱状细胞中增殖,也能在中肠的杯形细胞中增殖,甚至在感染后期能在家蚕幼虫的大部分组织细胞中感染和增殖。     

家蚕浓核病毒中国(镇江)株结构蛋白的生物信息学比较分析

运用生物信息学方法将家蚕浓核病毒中国(镇江)株的结构蛋白与其它类型家蚕浓核病毒的结构蛋白在理化特性、结构、功能等方面进行了比较分析。结果表明:家蚕浓核病毒结构蛋白是一类稳定的亲水性蛋白,BmDNV-ZJ与BmDNV-2的结构蛋白性质可能比较类似,而BmDNV-ZJ和BmDNV-1结构蛋白序列的理化性参数、序列内部重复片断以及折叠区域差异较大,表明这两种浓核病毒结构蛋白在性状、结构、功能上有较大差异。而BmDNV-ZJ和BmDNV-1结构蛋白序列中有3个不同的LCR功能区域。分子进化聚类分析可得到四大类浓核病毒结构蛋白。     

家蚕浓核病毒 (中国镇江株)在不同感受性宿主体内的复制

家蚕浓核病毒中国镇江株是一株双生浓核病毒(bidensovirus)。其宿主感染后的病症与典型的家蚕浓核病毒(BmDNV-1伊那株)表现相似,病蚕软化,中肠的圆筒型细胞呈浓核症。该病毒的最大特点是基因组中含有二套DNA分子(VD1,VD2),这两种核酸分子以单链( VD1,-VD1, VD2,-VD2)线型方式被分开包装在各自的衣壳蛋白中,成为四种病毒体,而且它自身编码DNA聚合酶。有部分蚕品种对该病毒表现完全抗性,即不发病。分别对敏感性家蚕品种(华八35)和抗性家蚕品种(秋丰d)的幼虫进行经口接种病毒。在接种后,从2h到96h分9个时间点,对中肠组织进行取样。以家蚕细胞质肌动蛋白A3(actinA3)基因作为参比基因,用来标定取样组织细胞数。针对VD1和VD2分别设计特异引物,用荧光定量PCR的方法分别检测各个时间点的样品中的病毒基因组VD1和VD2拷贝数。结果表明:无论是在感性还是在抗性宿主体内,家蚕浓核病毒中国株的基因组VD1和VD2在各时间点拷贝数相近,表现出VD1和VD2是同步复制的;病毒侵入两种宿主中肠的初始量(接种后2h)基本相等,每个细胞约为6~10拷贝数。在敏感性宿主体内病毒感染过程表现为潜伏期,指数增长期,平台期。从接种后2h到12h为病毒潜伏期;12h到36h为指数增长期,倍增时间为1·71h,大约扩增15次;36h到96h为平台期,进入平台期病毒的拷贝数达到20万个。在抗性宿主体内病毒处于一种极低水平的增殖,从添毒后2h的6~10拷贝数到96h的150~200拷贝数,病毒复制倍增时间分别为3h和12h,大约扩增5次。推测家蚕对浓核病毒中国株的抗病性,只是一种慢性的带毒不发病的表现。     

家蚕二分浓核病毒感染家蚕后的释放动态研究

【目的】研究家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)感染家蚕后不同时间段内释放到环境中的病毒量,为通过蚕沙快速检测病毒提供方法和依据。【方法】选取家蚕二分浓核病毒基因组节段VD1上的ns1基因和VD2上的ns3基因中的一小部分片段,分别克隆到p MD18-T载体上,制备标准品质粒,并用实时荧光定量PCR的方法绘制ns1和ns3的标准曲线。通过检测Bm BDV感染5龄家蚕后不同时间蚕沙中的病毒量来衡量释放到环境中的病毒的变化动态。【结果】在病毒感染家蚕第3天,大量的病毒随蚕沙释放到环境中,每微克蚕沙中约含1.38×106个VD1,6.54×105个VD2;从感染后第5天开始,释放到环境中的病毒量呈指数型增加;第7-8天病毒的释放量到达一个平台期,此时每微克蚕沙中约有2.12×107个VD1,1.34×107个VD2。普通PCR结果也反应出了类似的病毒释放动态。【结论】根据Bm BDV感染家蚕后的释放动态,推测病毒的复制周期约60 h。利用实时荧光定量PCR检测蚕沙中的Bm BDV,能简单、快速、准确地诊断病毒的感染。     

家蚕浓核病毒DNV-3（中国株）的VD2基因组序列分析

浓核病毒BmDNV-3(中国株)基因组中含有两种不同的单链线形DNA分子(VD1,VD2)。该病毒的VD2被分离、纯化、克隆到pUC119载体上,并完成了VD2全基因组序列的测定。序列分析显示:VD2全基因组长为6022个核苷酸,末端拥有524个核苷酸反向重复序列(ITRs)。VD2基因组正链含有2个大的开放阅读框,负链含有1个小的开放阅读框。计算机分析推测该基因组正链上开放阅读框(ORF1)及负链上开放阅读框(ORF3)主要编码病毒的非结构蛋白,而正链上开放阅读框(ORF2)主要编码病毒的结构蛋白。比较BmDNV-3 VD2和BmDNV-2(Yamanashiisolate)VD2基因组全序列,两者同源性达97.7%,并且有132个碱基的替代1、1个碱基的删除和2个碱基插入。研究结果显示BmDNV-3 VD2和BmDNV-2 VD2有很近的亲缘关系,但也发生一定的变异,这为更好地理解浓核病毒种类的多样性,也为研究家蚕浓核病毒进化提供了有益的线索。     

创建可视化的家蚕杆状病毒表达系统表达家蚕二分浓核病毒非结构蛋白NS1

重组杆状病毒感染昆虫细胞是表达外源蛋白常用的一种方法。为有效鉴定转染的细胞中是否产生了重组病毒粒子,对质粒pFastBacI进行改造,构建了极早期基因ie1启动子控制的绿色荧光蛋白egfp基因表达盒,以及多角体基因启动子控制的外源DNA的一个通用型双表达载体;通过酶切、连接的方式,将家蚕二分浓核病毒ns1基因连接到多角体启动子下游;在转座酶的介导下,该供体质粒上部分序列可转座到穿梭载体Bm-Bacmid上,进而构建可同时表达egfp和ns1基因的重组杆粒。将构建的该重组杆粒DNA转染BmN细胞,通过观察可视化的绿色荧光信号,可迅速判定转染后的细胞中重组病毒粒子产生的情况,收集转染后的细胞培养上清,将其感染BmN细胞,对感染4 d后的细胞总蛋白进行Western blotting分析,结果表明能杂交到一条36 kDa大小的特异蛋白,表明NS1蛋白成功获得了表达,进而为深入研究ns1基因的功能奠定了基础。     

家蚕浓核病毒 Bm DNV-3(中国株)VD1基因组结构与转录分析

为了进一步认识家蚕浓核病毒BmDNV-3(中国株)VD1基因组的结构和功能,VD1被分离、纯化、克隆到pUC119载体上,完成了基因组全序列的测定。序列分析显示VD1基因组全长为6543个核苷酸,末端拥有224个核苷酸反向重复序列(ITRs)。VD1基因组正链含有3个大的开放阅读框(ORF1-3),负链含有1个大的开放阅读框(ORF4)。比较BmDNV-3的VD1和BmDNV-2(Yamanashiisolate)的VD1基因组全序列,两者同源性为98.4%,并且有107个碱基的替代和1个碱基插入,氨基酸突变集中在VD1ORF3和VD1ORF4。Northern杂交结果显示VD1的左边正链上有1.1kb和1.5kb两个转录本,右边的负链上有一个3.3kb转录本。3′和5′-RACE结果显示1.1kb转录本开始于nt290,结束于nt1437;1.5kb转录本开始于nt1423,结束于nt2931;3.3kb转录本开始于nt6287,结束于nt2922。正链上1.5kb转录本和负链上3.3kb转录本拥有10个核苷酸的3′端的共同序列。研究结果显示该病毒基因转录与已报道的其它浓核病毒存在较大的差异性。     

家蚕浓核病毒(镇江)株主要结构蛋白基因的克隆及表达

家蚕浓核病毒(Bombyx mori densovirus,BmDNV)是一种昆虫细小病毒.与其它昆虫细小病毒感染昆虫体内多种组织不同,家蚕浓核病毒只感染家蚕中肠上皮组织的圆筒型细胞,感染该病毒细胞的细胞核可以被孚尔根和甲基绿浓染,在病毒感染的早期中肠上皮组织细胞数量增加,形成褶皱,最后感染细胞脱落到肠腔中[1-3].自从20世纪70年代末日本学者证实家蚕浓核病是由于家蚕浓核病毒感染引起的以来[4],已经分离得到了多个病毒株系[5-8].根据它们在血清学、理化特性、品种感受性和病理特征等方面的差异,分为BmDNV-1(伊那株)和BmDNV-2(以山梨株为代表)[8-11].     

感染家蚕浓核病毒BmDNV1对家蚕抗性和敏感品种生化参数的影响

在家蚕疾病中,病毒性疾病是危害茧产品的主要且最普遍的疾病。病毒性蚕软腐病是由BmIFV, BmDNV1 和 BmDNV2引起的。对印度种质库（Indian Germ plasm stock）中的BmDN V1有抗性和敏感的家蚕品种进行了鉴定。利用标准方法对在BmDNV1感染过程中抗性和敏感品系的主要有机成分的变化（包括总蛋白、碳水化合物和脂类）进行了检测。结果表明： 随着幼虫年龄的增长,对照组和处理组中有机成分（即蛋白质和碳水化合物）的含量也随之增长,但是处理组的增长水平明显地低于各自对照组的增长水平。接种BmDNV1后,与对照组比较,敏感品种体内的血淋巴和中肠组织的总蛋白的量显著地下降。在抗性品种,接种4天后的总蛋白的量有了显著地下降,之后,下降水平小于各自的对照组。在抗性和敏感品种中,血淋巴和中肠组织中的总碳水化合物的量略有下降。在变化不显著的抗性和敏感品种中,血淋巴和中肠组织中的脂质的量有显著地提高。在敏感家蚕品种,生化变化清晰地显示： BmDNV1感染消耗作为主要能量来源的总蛋白和碳水化合物。这些成分的损耗导致了被感染家蚕的生长受阻。     

应用明胶凝集颗粒试验检测人群中T细胞白血病病毒抗体

曾毅等报道,应用间接免疫荧光法(IIF)检测了8,279份正常成年人血清标本,发现3例T细胞白血病病毒(HTLV)抗体阳性:一例马杨氏,丈夫是日本人(HTLV抗体也阳性),侨居南京46年;第二例是台湾籍妇女;第三例是位侨居北京的日本人。650份各类白血病病人血清中,一例成人T细胞白血病患者HTLV抗体阳性,此人是船员,常去日本。     

炭凝集试验快速检测轮状病毒的研究

用炭凝集试验检测轮状病毒,结果表明该法是一种简便、快速、特异的诊断方法.用炭凝集试验及聚丙烯酰胺凝胶电泳法对105份粪样进行检测,结果两法阳性检出率无显著性差异,说明炭凝集试验可应用于临床.     

"EXTRANUMERARY" CUTICLE DEPOSITION IN PIECES OF LARVAL INTEGUMENT TRANSPLANTED TO A PUPA IN THE SILKWORM BOMBY X MORI

The author (K ato , 1973b) reported that in Bombyx mori , pieces of larval integument, if transplanted to a pupa, produced two layers of cuticle during the metamorphosis of the host pupa to an adult. In the present transplantation experiments, deposition of the two layers of cuticle was temporally examined to determine the timing of the two depositions, compared with the host's cuticle deposition, using 0-day-old fifth-instar or 1-day-old fourth-instar larvae as donors. In the transplant the first deposition occurred within 4 days of transplantation, with the second deposition at 6 to 8 days, while the host began cuticle deposition 6 days after receiving the transplant. These results show a failure of simultaneous deposition between the transplant and the host. These moulting events in the transplant, e.g. , the fairly early appearance of the first cuticle and temporally-separated ecdyses, are discussed in view of the change of ecdysone titer in the host. Furthermore, the temporal pattern of cuticle deposition in the transplant appeared to have a definite relationship with the type of cuticle deposited.     

AFLP标记在研究家蚕遗传多态性方面的应用

AFLP是一种多态检出效率很高的分子标记技术,在构建遗传图谱,遗传多态性研究,重建分子系统演化树,品种鉴定,基因克隆等众多研究领域有着其它分子标记技术不可比拟的优势。本文在前人用AFLP技术对植物多态性研究的基础上,将AFLP用于家蚕的遗传多态性研究,结果发现在家蚕中同样具有丰富的AFLP标记的多态性。由此暗示AFLP技术亦适合研究家蚕等昆虫类动物的遗传多态性,构建遗传图谱,或用于其分子生态学,分子进化和分类等方面的研究。此外本文还探讨了适合于家蚕等昆虫的AFLP分析的实验条件。     

激光诱变家蚕突变及其遗传育种的研究

本文报道了激光诱导家蚕单性生殖五年（１９８９—１９９３）来的研究结果。由于家蚕雌雄核受刺激的敏感性存在着差异,激光刺激不仅能使未受精的处女蛾卵发育产生孤雌生殖;而且能够破坏交配蛾卵的雌核发育产生孤雄生殖。试验结果说明激光诱发家蚕单性生殖具有明显效果,现已选育成“单性１号”和“单性２号”两个新突变体及其优良杂交组合“单性１号×皖５”和“单性１号×中８”,由于“单性１号”是斑纹限性品种,用它作母本的杂交种可为蚕业生产带来很大的经济效益。     

艾滋病血清学诊断新方法——免疫斑点法的建立

运用基因重组技术在大肠杆菌生产出有诊断意义的人免疫缺损病毒(HIV)蛋白,将其初步提纯,再用快速蛋白液相层析技术进一步纯化,即可直接点样至硝酸纤维膜,用来检测HIV抗体。实验显示,这种免疫斑点法(Immunodot assay,IDA)的敏感性与间接免疫荧光法(IIF)相同,而特异性比它高,与蛋白印迹法(WB)相近。由于IDA试剂成本比IIF低,可用于HIV抗体检测的初筛。与IIF相比,IDA法具有假阳性率低、试剂稳定性高、操作简便和不需要昂贵的荧光显微镜等优点。因而是一种适合在基层应用的方法。