抗HFRSV人单抗可变区基因克隆及其序列测定

从杂交瘤细胞株87—2提取细胞总RNA．反转录合成cDNA链,进行PCR反应。其中扩增重链可变区一对引物分别与人免疫球蛋白重链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补;扩增人λ轻链可变区引物与人免疫球蛋白λ轻链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补。将重、轻链可变区基因的PCR扩增产物分别插入M13噬菌体．经转化筛选分别获得重组克隆。双脱氧法测定其序列,所得核苷酸序列经计算机分析,轻、重链可变区基因长度分别为309bp和405pb,编码103个氨基酸和135个氨基酸,有明显抗体可变区特征,具有骨架区和抗原互补区。     

鼻咽癌恶性转化基因Tx核苷酸序列分析

从人类鼻咽癌细胞系CNE2基因组DNA文库中克隆一个恶性转化基因Tx转染小鼠JB6 + 细胞 ,使细胞恶性转化 ,宿主细胞具有停泊非依赖生长的特性 .已经报道的Tx中一个 3 0kb片段(Tx3 0 )的序列分析结果表明 ,Tx包含人类免疫球蛋白κ轻链完整的J区 .进一步对Tx全长进行亚克隆和测序 ,并采用生物信息学方法进行分析表明 ,Tx包含人类Igκ完整的J区、C区基因片段、还有 5个重组信号序列 ,1个核基质结合序列和 1个N segment的插入 .Tx与正常人IgκJ、C区比较只是在某些位点存在碱基的缺失、插入或置换 ,二者同源性高达 98% ,其电子定位于 2p11 2 ,这与人Igκ的染色体定位是一致的 .可以认为 ,Tx是一个缺乏V区的异常的人类免疫球蛋白kappa轻链基因     

利用酵母人工染色体（YAC）减数分裂同源重组构建人免疫球蛋白κ链基因组大片段

具有同源重叠区的酵母人工染色体(YAC)可以利用酵母细胞减数分裂进行同源重组,从而构建更大的人工染色体基因组,这对生命科学基础研究和生物技术应用研究有着非常重要的意义。本实验以两个含人免疫球蛋白κ链基因簇片段的YAC克隆为材料,通过酵母改型、异型接合、二倍体发孢、单孢子筛选和分子生物学鉴定等技术和方法,利用酵母菌减数分裂同源重组机制,构建了一条包含人的免疫球蛋白κ轻链32个Vκ基因、5个Jκ基因、Cκ基因、Eκ基因和κde基因的YAC重组体,长度约400kb。同时,本实验利用溶壁酶消化法获取单孢子重组体,代替了传统的显微分孢操作。使得利用酵母人工染色体减数分裂同源重组的技术更加简便可行。     

利用酵母人工染色体(YAC)减数分裂同源重组构建人免疫球蛋白κ链基因组大片段

具有同源重叠区的酵母人工染色体(YAC)可以利用酵母细胞减数分裂进行同源重组,从而构建更大的人工染色体基因组,这对生命科学基础研究和生物技术应用研究有着非常重要的意义。本实验以两个含人免疫球蛋白κ链基因簇片段的YAC克隆为材料,通过酵母改型、异型接合、二倍体发孢、单孢子筛选和分子生物学鉴定等技术和方法,利用酵母菌减数分裂同源重组机制,构建了一条包含人的免疫球蛋白κ轻链32个Vκ基因、5个Jκ基因、Cκ基因、Eκ基因和κde基因的YAC重组体,长度约400kb。同时,本实验利用溶壁酶消化法获取单孢子重组体,代替了传统的显微分孢操作。使得利用酵母人工染色体减数分裂同源重组的技术更加简便可行。     

史氏鲟免疫球蛋白重链可变区序列及多样性

为了研究史氏鲟免疫球蛋白重链可变区基因的组织结构和多样性,采用RTPCR技术从史氏鲟(Acipenserschrenckii)脾脏总RNA中获得了免疫球蛋白重链可变区cDNA克隆,随机挑取31个阳性克隆进行测序。结果表明:所有序列相同率高于75%,前导肽相同率高于90%,应属于同1个VH家族。其变异主要存在于互补性决定区,特别是CDR3区。在D片段序列中发现大量保守的基因序列(motif)。并发现多个VH基因片段可以共用一个J片段的现象。在基因组DNA重排过程中,VH片段可以与任意的D和J片段结合。此外,史氏鲟免疫球蛋白重链可变区的VH,D和J片段的随机重排外,外切核酸酶作用,以及在重排位点大量N,P片段的插入现象,都大大增加了鲟鱼免疫球蛋白的多样性。     

人免疫球蛋白重链可变区基因引物设计方法的改良

针对抗体胚系基因数据库的数据不断更新和完善,为获得人全部免疫球蛋白(Ig)重链可变区基因,改进引物设计方法,自主设计针对可变区基因高度保守的框架区1(FR1)和框架区4(FR4)的引物,提取未经免疫的健康人外周血单个核细胞,通过RT-PCR扩增重链可变区基因.其DNA序列与GenBank数据库和IMGT/V-QUEST软件比对,序列分析符合人免疫球蛋白重链基本框架结构,为胚系基因重排产生的序列.多个克隆的测序结果对比分析显示了良好的多样性.获得的重链序列为研制基因工程抗体及构建噬菌体抗体库奠定了物质基础,也为扩增其他物种Ig可变区基因的引物提供新的设计思路.     

染色体转位(Translocation)与癌症

许多种癌症是由染色体转位引起的。这是因为转位使原癌基因活化并过量表达,或是转位使基因融合。大部分已确认的转位都与免疫系统(免疫球蛋白和T细胞受体基因)本身固有的V(D)J重组有关。此外,外界因素,如电离辐射和某些化学药物等因素使DNA双链断裂,也可能导致染色体转位和癌变。了解染色体转位和癌变机制,对临床诊断和防治具有重要应用价值 。     

抗D－双聚体单抗轻链可变区基因的克隆

以分泌小鼠抗人纤维蛋白降解产物D－双聚体单克隆抗体杂交瘤细胞株的mRNA为模板,用小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因的通用引物,通过RT－PCR扩增基因,与载体重组后,经酶切鉴定和核苷酸序列分析,证明克隆含抗D－双聚体单抗的轻链可变区基因,长度为330 bp．     

抗乙型脑炎病毒单抗重链可变区基因的筛选和鉴别

为了制备抗乙型脑炎病毒的人-鼠嵌合抗体,以分泌抗乙型脑炎病毒单抗的51-8杂交瘤细胞株为材料,分离这一单抗的重链可变区基因。杂交瘤细胞的大分子量DNA经Bam HI部分酶切后,以λEMBL-3为载体,构建了总数为2×10~7pfu的基因文库。以抗乙脑病毒单抗重链可变区cDNA为探针,从360000个噬菌斑中筛选出9个阳性斑,经点杂交及Southern杂交证明它们都含有重链可变区基因的片段。进一步以J_(11)探针(含J_3、J_4和重链增强子)对其中4个重组体进行鉴别。经EcoRI酶切后,有3个重组体含有与肝细胞和Sp2/0细胞相同的3.8kb片段,而第4个重组体(λ8a4)没有这一片段,却有一个4.5kb片段,这是在肝细胞和Sp2/0细胞中不存在的。从而证明前3个重组体的插入片段是未经重排的重链可变区基因片段,而λ8a4中的插入片段含有经过重排的功能性可变区基因。这一4.5kb片段不能与含有J_1—J_2的探针杂交,却同时含有V_H、J,或/和J_4和增强子。进一步证明,这是一个功能性的可变区基因。因此,将这一4.5kb片段分离出来之后,在pUC19中亚克隆并作酶切图。为构建抗乙脑病毒的人-鼠嵌合重链基因奠定了基础。     

小鼠(BALB/c)未分化型免疫球蛋白重链可变区(V_H)基因的克隆

我们曾报道了由小鼠胎儿基因文库中克隆未分化型免疫球蛋白重链恒定区C_s基因的研究结果。与此同时我们还从小鼠基因文库中克隆出未分化型免疫球蛋白重链可变区V_H基因。并对其进行了初步的研究。免疫球蛋白的重链和轻链可变区的空间叠折形成了抗原-抗体结合位点,这对于结合特异抗原具有重要作用。因此克隆与研究免疫球蛋白可变区基因对于认识抗体的特异性、多样性都有一定的意义。 我们从相当于一个小鼠基因组的1.2×10~6个重组子中,克隆到8个V_H基因,并从其中之一分离到5.0kb的含免疫球蛋白重链可变区V_H基因的DNA片段。