几种mRNA在无细胞系统中的翻译

<正> 信使核糖核酸(mRNA)的分离与测活,在基因表达与调控、核酸结构的分析、以及基因工程等方面的研究中占有特殊的地位。一个目的基因的分离可以通过mRNA逆转录成cDNA而钩出此基因,所得基因可以进行核苷酸的序列分析,同时还可以进行调控序列的分析;又如可以借助mRNA探针从基因文库中钩出目的基因,也可以通过mRNA筛选出所需要的克隆。因此mRNA的研究已成为分子生物研究中重要手段。     

植物mRNA和多聚核糖体的分离

分离植物mRNA是植物分子生物学研究的重要手段之一。它直接关系到基因表达与调控的研究。还可以从mRNA获得互补DNA(cDNA),进而制备基因。真核生物的mRNA通常在其3-端含有poly(A)(多聚腺苷酸),可     

破色期番茄果实均一化cDNA沉默文库的构建和功能基因筛选模型的初步建立

番茄果实的成熟是由多基因精细调控的一个过程．利用破色期番茄果实,根据复性动力学原理在mRNA水平进行均一化操作使高丰度和低丰度的mRNA丰度接近．然后把均一化之后mRNA反转录得到cDNA,再与基因沉默载体pTRV重组,最后把构建好的载体通过电转化的方法转入到GV3101农杆菌中,从而建立起破色期番茄果实均一化cDNA沉默文库．通过番茄果实中病毒诱导基因沉默技术,对cDNA沉默文库进行初步筛选,从而确定功能基因筛选模型．在模型建立阶段,以番茄红素合成途径相关的PDS基因作为内标基因,在100个混合农杆菌样中,成功筛选到了PDS基因．     

人胰岛素基因的核苷酸顺序已经解决

美国加州大学旧金山分校的Bell等人继解决大鼠胰岛素基因核苷酸顺序后,于今年三月宣布他们又解决了人胰岛素基因的核苷酸顺序。他们先从人胰岛素瘤提取胰岛素的信使核糖核酸(mRNA),经反向转录得到与此胰岛素mRNA互补的脱氧核糖核酸(cDNA)。为了得到更多量的cDNA,他们将其组入细菌质体(plasmid)DNA中,利用质体的     

cDNA合成和产量计算

以信使核糖核酸(mRNA)为模板合成互补的DNA链(cDNA),并以此单链DNA合成双链cDNA的技术是基因工程中最初的和重要的环节之一。本文根据研究工作的体会介绍cDNA合成方法,产量计算,影响cDNA合成的因素和解决的方法。一、cDNA合成方法自从1970年Temin和Baltimore 发现鸡骨髓瘤病毒逆转录酶以后,以mRNA为模板合成cDNA的技术很快应用到基因工程研究中。由于大多数合成反应都以polyA-mRNA为模板,因此需要加入寡聚脱氧胸腺核苷酸作为引物。底物是四种脱氧核苷三磷酸,其中一种     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为模板,经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR),扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pUC19转化至E.coli DH5α菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99.8％,氨基酸序列同源性达99.6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体。     

小拟南芥Chitinase基因的克隆与核苷酸序列分析

采用RT-PCR扩增方法,从野生资源小拟南芥（Arabidopsis pumila)的总RNA中,克隆获得了985bp的cDNA片段,经过测序和序列分析,发现该cDNA基因包含一个完整的963bp的开放阅读框（ORF）,含有17个限制性内切酶酶切位点,核苷酸序列同源性分析表明,该基因与与Arabidopsis thaliana glycosyl hydrolase family 19(chitinase)(Atlg 05850) mRNA,complete cds(登录号NM-100466.3),Arubidopsis thaliana putative class I chitinase(Atlg05850)mRNA,complete cds(登录号AY034935）,Arabidopsi8s thaliana chitinase-like protein 1(CTL1) mRNA,CTL1-ELPlallele,complete eds(登录号）AF422178）均有94%序列同源性,Chitinase可抑制病原真菌的生长,所编码的功能蛋白在提高农作物抗病性方面具有重要意义。     

菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为横板．经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR)。扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pucl9转化至E．Coli DH5a菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99．8％．氨基酸序列同源性达99．6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体．     

mRNA差异显示技术在动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用

动物从卵裂开始的早期胚胎发育始终伴随着mRNA不断的合成与降解。最初受着受精卵内母体mRNA的控制。当这些mRNA在发育过程中逐渐被降解时,有些动物（如小鼠）在比较早的时期已有新的基因的转录;而有些动物（如鱼类、两栖类）迟到囊胚中期以后,合子核的基因才开始转录新的mRNA。mRNA这各肯规律的代谢活动控制着细胞的分化、层的形成以及模式形成（pattem formation)。所有这些mRNA水平上的变化都可以用mRNA差异显示法（mRNA differential displsay)检测出来并进而获得与早期胚胎发育有关的基因。mRNA差异显示法是由Liang和Psardee于1992年建立起来的,用于显示两种不同组织之间mRNA差异的方法。基于绝大多数mRNA有一个poly(A)尾巴,选用一个较特殊的3’端引物－5’T11MN3’,其中M可以是dATP,dCTP,dGTP之一,而N可以是dATP,dTTP,dGTP之一,进行逆转录时,1／12的RNA可被逆转录为cDNA。这种cDNA第一链被用来PCR扩增,所使用的3’端引物与逆转录引物相同,而5’端引物为10个碱基的一个寡核苷酸,这类任意（aritrary)引物共有26种。这样,当我们利用一对引物进行RT－PCR时,1／312（12X26＝312）的mRNA可以被显示出来。将来自不同发育阶段胚胎的总RNA的RT－PCR产物在6％的聚丙烯酰胺变性胶上平等走电泳、放射自显影后即可知道胚胎之间在mRNA水平上的差别,然后从cDNA文库中钓取全长的cDNA或从基因文库中筛选完整基因并对其序列、结构、功能等方面进行研究,从而揭示不同发育阶段胚胎间性状上差异的根源。mRNA差异显示技术已在小鼠、大鼠、斑巴鱼、抓蟾等动物的早期胚胎发育基因的研究中得了应用,取得了较好的结果。     

人天然免疫基因BCL10的猪同源物的识别、克隆与初步表达分析

采用电子克隆方法克隆到大小为925 bp的人天然免疫蛋白BCL10的猪同源基因完整cDNA序列(GenBank登录号：EU088132), 并利用RT-PCR方法从猪的全血中扩增出包含702 bp的完整开放读码框架(ORF)的cDNA片段。经核酸测序, 证明与电子克隆结果相符。利用NCBI BLAST分析该cDNA包含3个大小为57 bp、289 bp和356 bp的外显子, 并且定位于猪的4号染色体上。采用半定量PCR技术检测基础水平猪各组织BCL10基因mRNA表达丰度, 并将该基因构建到带有绿色标签的真核表达载体pEGFP-C1中, 采用脂质体转染法将该基因转入PK-15细胞, 通过绿色荧光标记和RT-PCR方法检测实验组的BCL10蛋白表达。研究结果表明, BCL10基因mRNA在脾脏中表达最高; 胸腺、大脑和淋巴结表达次之, 而肝脏只有微量表达, 肾脏没有检测到表达; 同时BCL10基因在PK-15细胞中得到了有效表达。     

人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞(HUS-98)cDNA文库的构建及鉴定

为了进一步分离人尿道(阴茎)鳞癌组织特异性表达基因和鳞癌特异性相关基因,采用SMART技术,构建了人尿道 (阴茎)鳞癌上皮细胞cDNA文库,从人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞中分离总RNA并纯化mRNA,利用经修饰的oligo(dT)引物 合成cDNA第一链,利用SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5′端延伸出去的模板,采用LD-PCR合成双链cDNA,双链 cDNA经酶切和过柱分级分离后,克隆入λTriplEx2载体后经体外包装而成cDNA文库。结果表明原始人尿道(阴茎)鳞癌上 皮cDNA文库获得1.57×107个重组子,重组率达到98%。文库扩增后,滴度达到4.0×109pfu/ml,插入cDNA平均长度为2.5kb。 构建的人尿道(阴茎)鳞癌上皮cDNA文库具有良好的质量,该cDNA文库为进一步筛选鳞癌抑癌基因及鳞癌特异性表达基因 奠定了基础。     

紫稻(Oryza sativa L.)线粒体ATP合成酶atp6基因转录本RNA编辑

紫稻(Oryza sativa L.)细胞质雄性不育系紫稻A是本实验室构建的新型细胞质雄性不育系。本研究使用PCR、RT-PCR、DNA测序等技术,得到了紫稻细胞质雄性不育水稻不育系(樱香A)及其保持系(樱香B)线粒体atp6基因转录本cDNA序列。通过与基因组序列比对发现:樱香Aatp6cDNA序列中,没有发生RNA编辑;而樱香Batp6 cDNA序列中有16个编辑位点,在樱香B cDNA序列16个编辑位点位于15个密码子中,所编码的氨基酸均发生改变:在1003位点由C替换为T,导致原来编码谷氨酰胺密码子(CAA)成为终止密码子(TAA),保证atp6 mRNA编码一个正常的ATP6多肽;而由于没有发生RNA编辑,樱香A mRNA就不能翻译成正常的多肽。研究表明,RNA编辑在合成正常的ATP6多肽的过程中具有至关重要的作用,同时也说明RNA编辑可能与细胞质雄性不育相关。     

Ⅲ类内含子及其对基因表达的影响

内含子是指断裂基因中的非编码区序列。根据内含子的核苷酸序列和RNA潜在折叠方式不同,可分成四种类型：Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子、Ⅲ类内含子和Ⅳ类内含子。Ⅲ类内含子为真核细胞前mRNA中的内含子。它可以启动某些基因的表达,影响基因的表达量;增加mRNA分子的稳定性;并通过选择性剪接调控基因的表达。Ⅲ类内含子可以提高转基因动物基因的表达效率。因此,基因工程中,为了提高表达效率,是选用基因组基因还是cDNA基因,应视具体基因而定。     

PCR检定OSM cDNA转染细胞中基因组整合与转录

用PCR和RT-PCR方法对人OSM cDNA转染的小鼠黑色素瘤细胞进行基因组整合和mRNA转录的检定.基因组整合检定时,采用与调控序列和cDNA序列相对应的上、下游引物,以连续的转录单位进行扩增,能够更准确地反映整合与表达的关系;mRNA检定时,采用与cDNA序列和质粒克隆位点与加polyA信号之间序列相对应的上、下游引物,可以区分宿主细胞中内源性与外源性基因的转录.     

竞争性RT-PCR法及对大肠杆菌acrA基因mRNA表达水平的定量研究

建立了用于检测大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922的acrA基因mRNA表达水平的定量竞争性RT-PCR(QC-RT-PCR)体系。PCR合成目标片段的突变型片段(321bp)作为内标准模板(Internal standard,IS),与目标片段一致的片段(389bp)作为目标模板(Target standard,TS),优化两种模板共扩增体系;梯度稀释IS与等量大肠杆菌cDNA样本共扩增,扫描电泳条带,软件分析数据。结果表明,引物设计合适,以IS和TS为模板实现共扩增,产物(321bp和389bp)通过1.5%琼脂糖凝胶电泳有效分离;梯度稀释IS与cDNA共扩增产物出现亮度梯度电泳条带;获得一元回归曲线y=-0.345 0.097x(相关系数r=0.959,标准差s=0.05997)。该研究成功构建内标准模板,优化的共扩增PCR体系实现了对大肠杆菌ATCC25922中acrA基因mRNA表达水平的检测,具有简便、高效、敏感度高等优点。     

ATP：RNA腺苷酰转移酶的纯化及其应用

绝大多数真核细胞mRNA的3＇-端带有一段多聚腺苷酸即poly(A)的结构,在基因工程的研究中经常以这样的mRNA作为模板,以寡聚(dT)12—18作为引物,通过反转录酶的作用得到互补于该mRNA的DNA(即cDNA),再经克隆增殖等技术可得到相当量的基因,从而能进一步进行各种研究。近年来这些技术也常用于病毒RNA基因组的研究。Devos等人利用ATP:RNA腺苷酰转移酶使3＇端无poly(A)的病毒RNA基因加上一段poly(A),     

重组DNA技术(续)

四、DNA的体外重组 DNA重组技术,当用于干扰素、胰岛素、疫苗、免疫球蛋白等物质的生产时,目前多半采用从mRNA反转录成cDNA,然后和载体DNA重组,再转化至大肠杆菌内进行复制和表达。在某一基因结构已清楚的情况下,亦可人工合成该基因(如人胰岛素基因等),再将该基因嵌入载体引进大肠杆菌中。若从基因库中分离出的基因,由于已含有内含子(Intron),     

抗性家蝇cDNA文库的构建(英文)

本文报道了以抗性家蝇头部为材料,参照“QuickPrep~(TM) Micro mRNA Purification Kit”和“Time-Saver~(TM) cDNA Synthesis Kit”操作程序构建的cDNA文库。库容量为每纳克cDNA可产生1×10~4pfu,其中90％以上为重组噬菌斑。目前,正用同源探针杂交技术进行目的基因的筛选。     

枸杞果实cDNA文库的构建

目的 :通过构建枸杞果实cDNA文库 ,分离类胡萝卜素合成酶基因。方法 :枸杞果实RNA的提取采用改进的异硫氰酸胍 -酚 -氯仿法 ,利用PolyATractmRNAIsolationSystem(Promega公司 )分离mRNA ,然后利用UniversalRibocloneRcDNASynthesisSys tem(Promega公司 )合成双链cDNA ,在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头 ,并与λExCell载体连接 ,利用PackageneLambdaDNAPackagingSystem进行包装。结果 :首次构建出滴度为 8 4× 10 4 pfu ml,重组效率为 86 9%的枸杞果实cDNA文库。结论 :构建出枸杞果实cDNA文库 ,为类胡萝卜素合成酶基因的分离奠定了基础