实验兔骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

探讨建立兔骨髓间质干细胞(BMSCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为BMSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。首先抽取兔髂骨骨髓,采用Percoll密度梯度离心法得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞,经胰蛋白酶消化后传代培养扩增,倒置相差显微镜观察细胞生长状态,细胞免疫组化检测CD73、CD34。结果表明,成功建立了兔BMSCs体外分离及培养扩增的方法,发现BMSCs表现贴壁生长,P0代时呈集落生长,细胞呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,形态开始多样化;细胞免疫组化显示BMSCs表达CD73,未表达CD34,反复传代后CD73表达效率增高。上述研究表明,Percoll密度梯度离心联合骨髓贴壁法,能有效分离、纯化和扩增BMSCs,提取的细胞具有BMSCs的生长特性和抗原表型,其中P3~P6代细胞增殖能力强,可用于进一步的研究工作。     

大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及鉴定

摘要 目的：研究大鼠BMSCs（骨髓间充质干细胞）原代培养与纯度鉴定的方法。方法：无菌环境中,从SD大鼠股骨与胫骨端采集骨髓,先行酶消化,利用全骨髓细胞悬液贴壁法对提取BMSCs实施传代培养,选取生长良好的第3代细胞进行鉴定;对BMSCs实施成脂与成骨诱导分化,同时经由油红O（ORO）与茜素红（ARS）染色法对诱导分化效果加以鉴定;借助流式细胞术（FCM）对CD34、CD44与CD90这3类BMSCs表面标志物的表达展开分析。结果：BMSCs是长梭状贴壁细胞,生长状态为纤维细胞样漩涡状;在第3代BMSCs传代期间,其第1-3 d发展至生长潜伏期,呈较慢速的生长;第3-5 d发展至对数生长期,呈高速生长;待至第7 d长速增殖最大,速度停止上升进入平缓期;BMSCs成骨、成脂诱导结束后,对其诱导分化鉴定发现：细胞出现明显形态学变化,通过ORO对脂肪染色,细胞显示橘红色;待成骨诱导培养结束,通过ARS对钙盐染色,显示红色,且出现矿化结节沉积,说明BMSCs具有良好的成骨、成脂分化能力;FCM测定发现：CD34表达呈阴性（1.09 %）,CD90（96.8 %）与CD44（92.4 %）皆呈阳性,与BMSCs表型相符。结论：经由全骨髓黏附培养技术有效分离BMSCs,且完成培养。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外原代培养及鉴定

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养以及扩增的方法并鉴定。方法：取100g左右雄性SD大鼠后肢股骨、胫骨骨髓,原代全骨髓培养法,多次传代纯化,体外扩增后,观察细胞形态,并免疫组化及流式细胞仪检测cd34、cd90、cd105细胞因子,鉴定是否为BMSCs。结果：所获取的细胞呈长梭形,呈现特征性的漩涡状生长,CD34阴性,CD90、CD105阳性。结论：利用全骨髓培养法成功分离骨髓间充质干细胞,10代以内的细胞纯度高,活性好。全骨髓培养较为简便、易行。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞体外分离、培养和鉴定方法,观察其生物学特性.方法:采集兔股骨及胫骨骨髓组织,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离、培养和扩增兔骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态,绘制原代、第1、3、8代细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面标志物,成骨和成脂肪诱导培养鉴定,观察细胞生物学特性.结果:培养的BMSCs呈纺锤形、长梭形,旋涡状排列、放射性生长,增值活跃.各代细胞生长曲线呈S型,细胞增值活跃.细胞表面标志物CD44分子阳性,CD34和CD45分子阴性.经成骨和成脂肪诱导后细胞碱性磷酸酶染色和油红O染色阳性.结论:成功建立了兔BMSCs体外分离、培养的有效方法,扩增的BMSCs仍保留多向分化潜能,是理想的组织工程种子细胞.     

小鼠骨片间充质干细胞分离培养及鉴定

目的建立小鼠骨片间充质干细胞（MSC）分离培养及扩增的方法。方法取小鼠胫骨和股骨,洗去骨髓后,用胶原酶I消化疏松骨密质,利用MSC具有迁徙和贴壁生长的能力进行分离。并对获取的细胞进行流式鉴定和诱导分化。结果培养2d小鼠骨片边缘爬出成纤维样细胞,呈克隆和鱼群样生长,并可以进行持续传代培养。流式鉴定结果显示这群细胞表达MSC标志Scall（92．7％）,CD29（98．4％）,CD90（91．6％）,不表达造血细胞标志CD34（1．57％）,CD45（3．99％）,CD11b（0．63％）,并可成功诱导分化成骨细胞和脂肪细胞。结论成功建立从小鼠骨片中获得MSC的方法,为实验研究提供可靠的细晌实源．     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的:寻求家兔骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem cells,BMSCs)培养与分离简单易行的方法,为下一步骨髓间充质干细胞在呼吸系统疾病的应用打好基础。方法:取3个月龄家兔1只,经双侧髂前上棘抽取骨髓共5.0 ml,密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合分离、纯化获得BMSCs,倒置差显微镜观察其形态学特性,流式细胞仪鉴定CD34、CD133表达。结果:接种细胞于24小时有少量细胞贴壁,72小时多数细胞可贴壁,贴壁细胞形态多为长梭型或多边形,原代细胞呈集落生长,12-16天可达90%融合,1%胰酶消化后传代培养,培养至第三代备用。流式细胞仪鉴定90%为骨髓间充质干细胞。结论:通过密度梯度离心法与贴壁筛选法可成功分离培养出骨髓间充质干细胞,此方法简单易行,成功率比较高。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外原代培养及鉴定

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分离培养以及扩增的方法并鉴定。方法:取100g左右雄性SD大鼠后肢股骨、胫骨骨髓,原代全骨髓培养法,多次传代纯化,体外扩增后,观察细胞形态,并免疫组化及流式细胞仪检测cd34、cd90、cd105细胞因子,鉴定是否为BMSCs。结果:所获取的细胞呈长梭形,呈现特征性的漩涡状生长,CD34阴性,CD90、CD105阳性。结论:利用全骨髓培养法成功分离骨髓间充质干细胞,10代以内的细胞纯度高,活性好。全骨髓培养较为简便、易行。     

大鼠ASC体外分离培养、鉴定及其双报告基因标记示踪

[目的]探索ASC高效分离方法,采用荧光基因标记法对分离的ASC进行标记、功能检测和示踪研究。[方法]通过优化脂肪组织的酶解消化条件,分别采用胶原酶、胰蛋白酶及组合对脂肪组织消化,检测细胞产量,并用流式细胞术进行鉴定。之后利用GFP-Fluc双报告基因对体外分离培养的ASC进行标记,鉴定其多项分化潜能。[结果]胶原酶、胰蛋白酶复合酶消化能够显著提高ASC分离效率,细胞产量较单一酶消化提高4~5倍。体外扩增培养ASC以表达CD29、CD90等为主。GFP-Fluc基因标记后的ASCs具有成脂肪、成骨分化潜能,可用于活体干细胞移植后的定量追踪。[结论]胶原酶、胰蛋白酶复合酶解法可以显著提高脂肪干细胞的原代分离效率4~5倍。     

应用犬骨髓间质干细胞作为组织工程种子细胞的实验研究

目的:将犬骨髓间质干细胞(BMSCs)分离、扩增,观察生长情况,评价其作为组织工程种子细胞的可行性.方法:采用密度梯度离心及贴壁筛选法分离犬BMSCs,培养扩增,通过免疫细胞化学方法进行鉴定,Hoechst33342标记后传代,检测细胞荧光.结果:分离的BMSCs经免疫细胞化学方法观察到SH2-ir、Vimentin.ir、a2-SMA-ir细胞,标记后细胞生长旺盛,荧光无衰减.结论:BMSCs可以作为构建组织工程的种子细胞.     

肝癌肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）体外扩增及特性研究

探讨从原发性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者的术后肿瘤组织中分离肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte,TIL）,并进行体外大量扩增的方法。在该研究工作中,组织标本来源于术后的肿瘤癌旁组织,经过组织破碎、酶消化后,采用不连续密度梯度离心分离其中淋巴细胞。分离的淋巴细胞先采用大剂量重组人白介素2（IL-2）（2 000 U/mL）进行引发,然后采用同种异体的外周血单核细胞作为饲养细胞进行扩增。针对9例原发性肝癌术后标本,所分离的TIL均能成功进行培养扩增,扩增后细胞数为（1~5.5）×10^9。扩增倍数为111~572。扩增后的TIL,表型检测发现CD3＋细胞的比例为（90.3±9.4）%,CD3＋CD4＋细胞的比例为（24.9±14.1）%,CD3＋CD8＋细胞的比例为（56.4±20.2）%,CD3＋CD56＋细胞的比例为（14.8±12.6）%。杀伤检测结果显示,肝癌TIL对非自体肿瘤细胞系HepG2和Bel-7402有较强的杀伤作用。因此,采用该改良的方法,原发性肝癌的TIL在体外可以成功进行培养扩增,并具有较强抗肿瘤活性,可以作为肝癌术后巩固性免疫治疗的一种手段。     

兔BMSCs复合纤维蛋白胶在体外分化为角膜基质细胞的研究

目的：探讨体外诱导兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为角膜基质细胞的可行性,并观察纤维蛋白胶（FG）作为细胞支架材料的效果。方法：密度梯度法获得BMSCs,体外诱导实验将细胞分为三组：对照组用普通培养皿、BMSCs培养条件并不加角膜基质细胞共培养的条件下培养;非FG共培养组使用普通培养皿并与角膜基质细胞共培养诱导BMSCs分化;FG共培养组使用铺有FG的培养皿并与角膜基质细胞共培养诱导BMSCs分化。培养1w及2w后用WestenBlot法检测三组细胞Keratocan的表达,在相差显微镜下进行形态学观察。结果：原代培养的BMSCs表现出成体干细胞潜能,CD29染色阳性,符合骨髓基质干细胞的特征。诱导培养2周后对照组BMSCs融合成单层、呈条索状生长;非FG共培养组部分细胞体积变小、多突起,局部呈梭形生长;FG共培养组细胞生长状态良好,部分细胞呈梭形或纺锤形,与FG生物相容性好。Westen检测结果：BMSCs细胞在纤维蛋白胶或普通培养皿上特定培养条件下均能诱导表达角膜基质细胞的特异性蛋白Keratocan。结论：骨髓间充质干细胞在条件培养基下可分化为角膜基质细胞,有望作为治疗角膜疾病及角膜组织工程的备选材料,纤维蛋白胶组织相容性好,可为组织工程提供移植细胞片。     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的建立一种从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞（MSCs）的高效方法。方法采取贴壁细胞分离法分离和纯化小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）,检测mMSCs在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化能力,用流式细胞术及显微镜分别检测mMSCs纯度和形态特征。结果mMSCs贴壁生长后形态较均一,细胞形态呈成纤维细胞样,流式细胞术检测：CD45、CD11b、CD44及CD29分别为（3.34）%、（2.41）%、（98.46）%及（99.36）%。第4代mMSCs经诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化。结论通过贴壁培养可以从小鼠骨髓中分离培养出高纯度mMSCs,该方法效率高,稳定性好。     

分步消化法原代培养鼠阴道黏膜上皮细胞的研究

目的探讨大鼠阴道黏膜上皮细胞的体外培养和扩增技术,为构建组织工程化阴道动物模型提供种子细胞。方法取大鼠阴道全层组织,经Dispase酶和胰酶分步消化后,接种于无血清角化细胞培养液中连续培养,观察细胞形态、体外生长特性和超微结构,绘制生长曲线,免疫组化鉴定。结果原代细胞培养24-36 h后开始贴壁,7-10d约80%融合,呈铺路石样外观,可连续传5-6代;扫描电镜下细胞表面可见微绒毛嵴;角蛋白染色阳性,细胞纯度98%;第五代细胞为正常二倍体核型。结论该方法培养的阴道上皮细胞增殖状态良好,细胞纯度高,扩增迅速,可在较短时间内获得大量细胞用于组织工程学研究。     

人骨髓间充质干细胞在精原细胞培养条件下生物学特征的观察

目的体外分离培养流产4h、八月龄男胎的骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察BMSC在精原细胞培养条件下的生物学特征,探讨人骨髓间充质干细胞诱导分化为精原细胞的可行性,为BMSCs作为"种子细胞"开辟新的途径。方法分离培养、鉴定人BMSCs,研究其在精原细胞培养条件下诱导培养BMSCs并观察其生物学特征。结果 BMSCs具有间充质细胞的特征;实验组细胞形态发生变化,免疫组化显示Oct-4和C-kit染色阳性;对照组细胞则无。结论人胎儿BMSCs有较强的增殖能力;人胎儿BMSCs在精原细胞培养条件下诱导培养,能表现出精原细胞的一些生物学特征。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定的实验研究

摘要 目的：探讨应用全骨髓贴壁法体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs)的可行性,研究其生物学特性,为骨组织工程提供种子细胞。方法：取SPF级5周龄健康SD大鼠2只,脱颈处死,分离双下肢股骨、胫骨,全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;通过倒置显微镜观察原代、传代细胞生长情况、绘制生长、贴壁率曲线,研究其生物学特性;流式细胞仪检测表面标志物、诱导成成骨等方法进行鉴定。结果：应用全骨髓贴壁法可在体外分离出活性好、纯度高的BMSCs。倒置显微镜下可见原代细胞呈梭形、多角形,传代细胞形态均一呈纤维样;P3代BMSCs经流式细胞鉴定：CD44、CD90高表达,CD31、CD45低表达;定向诱导向成骨细胞分化,可见明显矿化结节。结论：证实应用全骨髓贴壁培养法体外可成功分离BMSCs,所分离培养、纯化的细胞生物学稳定,纯度高、活性好,具有多向分化潜能,能为骨组织工程、骨质疏松症和骨折不愈合疾病的研究提供种子细胞。     

大电导钙激活钾通道对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

为了观察开放和拮抗大电导钙激活钾通道（bigconductanceCa2＋-activated砧channel．BKca）对大鼠骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）增殖的影响并探讨其机制,该研究分离培养了大鼠BMSCs,采用BKca通道特异性开放剂msl619）和拮抗剂（IBTX）干预,MTT、平板克隆测定细胞增殖活力及细胞克隆形成能力;流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期分布;Westernblot、定量PCR检测周期蛋白cyclinD1基因和蛋白表达水平;整细胞膜片钳技术分析细胞膜电生理特性。结果显示,NS1619干预组与对照组相比,BMSCs~胞膜科通道外向电流振幅增大,细胞增殖能力和克隆形成能力增强,凋亡减少。此外,开放BKca通道明显促进细胞从G1期向S期过渡,cyclinD1蛋白7LmRNA表达上调,而拮抗BKca通道则相反。推测,BKca通道通过调节细胞周期进程最终影响细胞增殖,该作用可能与其具有调控细胞膜心电流的电生理特性有关。     

肝细胞生长因子对人羊水干细胞迁移和黏附能力的影响

目的分离培养及鉴定羊水干细胞（hAFSC）,并研究肝细胞生长因子（HGF）对羊水干细胞迁移、黏附能力的影响。方法使用细胞贴壁法分离培养羊水干细胞,细胞免疫荧光及westernblot鉴定羊水干细胞,Transwell小室分析HGF对羊水干细胞迁移的作用。明胶贴壁法分析HGF对羊水干细胞黏附能力的作用。两组之间数据的比较采用独立样本t检验。结果分离的羊水干细胞均表达特异性标记物Oct-4、c-kit、SSEA-4、CD105。HGF在体外对hAFSC的迁移有趋化作用,对照组和HGF组每个视野的迁移细胞数分别为38±2.5和80±3.2。对黏附能力有促进作用,对照组和HGF组每个视野的黏附细胞数分别为19±1.5和50±2.7,差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论 HGF可趋化羊水干细胞的迁移,增强羊水干细胞的黏附能力。