ATP生物发光测定试剂研究进展

萤火虫荧光素酶是ATP生物发光试剂的关键组成部分,可通过萤火虫尾提取纯化或基因工程技术制备,酶的活力和纯度决定了ATP生物发光试剂的性能。迄今许多先进技术在ATP生物发光试剂的制备中均有应用,包括酶基因工程改造技术、ATP循环的酶法放大技术、荧光素酶蛋白的活力及发光稳定技术,特异的细胞ATP提取技术等。ATP生物发光试剂的研究焦点主要集中在提高发光试剂的检测灵敏度和性能、增加产品的适应性等方面。     

生物ATP含量测定系列产品卅年经营信誉第一

名称说明价格生物化学发光检测仪35100元/套荧光素酶-荧光素用荧光素酶系缓冲液配成3mg/mL,即为测定所用的荧光素酶液698元/克1g荧光素酶-荧光素可以测定416个样本保存条件:-30℃,干燥荧光素酶系缓冲液(粉剂)保存条件:4℃198元/10支标准ATP(粉剂)保存条件:-30℃,干燥12.8元/支凡是有飞机航班直达的城市,均为用户办理航空托运,另收取代办费用:虹桥机场178元,浦东机场208元,并开具发票。联系人:顾俭本;联系地址:中国科学院上海植物生理研究所,上海市枫林路300号(邮政编码:200032);联系电话:021-64161131,13818791309。生物ATP含量测定系列…     

化学合成的萤火虫荧光素的理化性质

萤火虫荧光素酶(luciferase,简称荧光素酶)发光系统是各类生物发光中研究得最深入,最透彻的一类,也是生物发光分析中应用得最广泛的一种。在国外,有关生物发光分析试剂都已商品化,而国内则很少,只有粗荧光素酶。荧光素是有关生物发光分析中必不可少的有机试剂。为此,我们研制了荧光素,并与国外产品作了比较。     

微量ATP的荧光素酶分析方法的研究

利用荧光素酶发光系统、测定ATP及有关的代谢物和酶的方法首先为McElvoy和Strechler报道。荧光素酶系统的发光机制可归纳为二步反应:LH_2(荧光素) ATP AMP·LH_2 P-P (1)LH_2·AMP 1/2 O_2→L·AMP~* H_2O→L·AMP hγ H_2O (2) 由于这一反应系统简单、快速、灵敏、专一性强,因此,不仅在生命科学研究中有重要的用途,而且在工农医生产中,也得到日趋广泛的应用。本文旨在说明:1.自己装置的测量仪器灵敏度     

荧光发光测定AGPase活力方法初步建立及应用

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活力传统上采用32P同位素标记反应底物来测定,但因测定条件的限制而极大地影响了其应用.该研究依据荧光素酶催化荧光素生成发光氧化荧光素的原理,在优化基本反应体系、确立反应体系ATP浓度和荧光强度线性关系等基础上,初步建立了以荧光发光反应测定AGPase活力的新方法,并运用新方法测定了含有不同glgC基因拷贝数菌株的AGPase活力.测定结果显示,不同菌株AGPase活力随glgC拷贝数不同存在显著差异,且其变化趋势与理论预期一致,即新方法可用于AGPase活力的体外测定,且具有更加安全、灵敏、简便和成本低的特点.     

荧光素酶研究进展

荧光素酶（Luciferase）可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。萤火虫荧光素酶是分子量为60－64kD的多肽链,在Mg^2 、ATP、O2存在时,催化D－荧光素（D－Luciferin）氧化脱羧,发出光（λ=550-580nm）。细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的加单氧酶,它催化长链脂肪醛、FMNH2和O2的氧化反应,发出绿蓝光（λ=490nm）。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶可分别从萤火虫和发光细菌中直接提前,亦可用基因工程的方法进行生产。荧光素酶催化的发光反应能用生物发光检测仪进行灵敏、快速检测,因此该酶有多方面的途径,如应用于快速检测、报告基因分析、有毒有害物质分析等。     

一种快速、灵敏的血小板释放功能检测方法及其在抗血小板药物研究中的应用

本文报道了一种快速、灵敏的血小板释放功能检测方法:利用荧光素-荧光素酶在有ATP、Mg~(2+)、O_2存在时产生的生物发光素测定血小板ATP的释放量,以反映血小板的释放功能;研究了ADP、AA、胶原、凝血酶等四种诱导剂对血小板释放功能的作用,发现ADP的诱导释放能力较其他三者为弱;观察在不同剂量ADP和AA的诱导下,血小板聚集强度和释放能力之间的关系,研究了血小板数等因素对ATP释放功能测定的影响。应用该方法研究了Aspirin及活血化淤药物川芎嗪,毛冬青甲素对血小板释放功能的影响,发现Aspirin对AA诱导的释放反应有强烈的抑制作用。在以ADP诱导的释放反应中,川芎嗪的抑制作用较毛冬青甲素更为强烈。     

基因工程荧光素酶问世

中国科学院上海植物生理研究所研究采用分子克隆技术成功地构造了带虫荧光素酶基因的工程菌株、经微生物发酵,研制成功两种剂型的基因工程菌荧光素酶试剂:纯酶和粗酶。其测定ATP的最低浓度分别为10~(-14)～10~(-15)mol/ml和10~(-13)～10~(-14)mol/ml,酶活性达到天然酶水平,可以取代萤火虫荧光素酶,目前国内外尚无同类产品。经情报所国际联网检索证明:该研究成果达到国际先进水平,属国内首创。今年初这项上海市科委下达的科研项目通过专家鉴定。     

萤火虫荧光素酶和荧光素酶基因

自然界有一些能自身发光的昆虫。其中,以北美萤火虫(Photinus Pyralis)研究得较为广泛和透彻。早在1956年,Green和McElroy就得到了荧火虫荧光素酶(Luciferase)的结晶。次年,Bilter和McElroyS~得到了荧光素(Luciferin)的结晶。1961年,White等测定了荧光素的结构,并化学合成了荧光素。随后,生物学家们一直致力于研究荧光素酶的催化反应机制。     

48孔板荧光素酶报告基因实验边缘效应

为了研究48孔板荧光素酶报告基因实验边缘效应以及寻找可能消除边缘效应的方法措施。本研究用常规方法培养人胚肾细胞HEK293,运用脂质体转染试剂Lipofectamin 2000将荧光素酶报告基因质粒p GL4.13Z和内参质粒p RL-TK共转染入48孔板中的HEK 293细胞。转染后24 h用荧光素酶报告基因实验检测试剂测量细胞的荧光素酶活性,比较角落孔、边缘孔以及中间孔测定值的差异,以及内参照海肾荧光素酶活性校准后的差值,并通过细胞计数来观察此种差异是否与细胞数目和转染效率相关。在此基础上,寻找可能减小边缘效应的方法,如细胞种植入48孔板后将其室温静置、48孔板重叠、放弃使用边缘孔。运用48孔细胞培养板进行荧光素酶报告基因实验存在边缘效应,边缘孔与中间孔的荧光素酶活性测定值有显著的差异且有统计学意义(p0.05),而边缘效应的产生与细胞数目和转染效率无明显关联。细胞种植入48孔板后将其室温静置1.5 h、或重叠一个48孔板以及空置边缘孔都不能减弱边缘效应;然而将48孔板四周边缘孔填充液体(磷酸盐缓冲液(1*PBS),水),可以削弱边缘效应。用48孔细胞培养板进行荧光素酶报告基因实验会产生边缘效应,并可能造成对实验结果的误判;48孔板四周边缘孔填充相应的液体可以削弱边缘效应。     

荧光素酶研究进展*

荧光素酶 (Luciferase)可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。萤火虫荧光素酶是分子量为 60～ 64kD的多肽链 ,在Mg²⁺、ATP、O₂ 存在时 ,催化D 荧光素 (D Luciferin)氧化脱羧 ,发出光 (λ =550～580nm)。细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的加单氧酶 ,它催化长链脂肪醛、FMNH₂ 和O₂ 的氧化反应 ,发出绿蓝光 (λ =490nm)。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶     

荧光素浓度对于用荧光素酶测定ATP含量的影响

在粗荧光素酶液中加合成的荧光素和不加荧光素,观察其发光反应动力学,反应系统中外加荧光素后,发光强度明显增加,以适当低浓度的荧光素酶液的发光强度增加最大。在室温(20℃)下,不同贮放时间的荧光素酶液,其反应活性随贮放时间的延长而下降。外加荧光素后,反应活性可以恢复并达到最大后保持恒定。在-15℃贮放一年后的荧光素酶粉剂,反应活性下降,外加荧光素后,反应活性可以提高到原来的水平。     

利用荧光素酶生物发光体系测定Mg~(2+)-ATP酶结合和水解活性

本文应用LKB公司的ATP测液建立了Mg~(2 )-ATP酶的ATP结合及水解活性的测定方法;利用国产荧光素酶粗品在连串反应体系中建立测定Mg~(2 )-ATP酶结合活性的方法,并与水解活性相比较.对Mg~(2 )-ATP酶的去脂样品,Mg~(2 )-ATP酶与卵磷脂复合物以及微粒体样所做的测定表明,上述两种方法是可靠、简便的,尤其是利用国产荧光素酶粗品建立的ATP结合活性的测定方法,能避免水解对结合活性测定的干扰,刘其它的酶-底物的结合研究有参考价值.     

在大肠杆菌中合成的萤火虫荧光素酶的分离和性质

用生物工程技术将萤火虫荧光素酶基因转移到大肠杆菌,在大肠杆菌中合成荧光素酶。这种工程菌已可通过发酵大量培养,并从菌体分离得到接近纯化的荧光素酶。这种酶的分子量是103kD;巯基试剂5,5’-巯基-2(2-硝基苯甲酸)“DTNB”能抑制酶的活性;对于底物荧光素的K_m为1.2μmol/L;酶反应最适pH为7.77;酶催化的生物发光峰在560nm。     

膜Ca~(2 )-Mg~(2 )-ATPase连续自动分析方法

目前,膜ATPase的活性测定主要是利用ATP再生系统,以及测定ATP水解所释放Pi的方法。比色测Pi的方法为Fiske所开创。Lacy改用抗坏血酸作还原剂,还原磷钼酸,提高了灵敏度。通常在中止酶反应,进行Pi比色测定之前,使用离心或过滤去除变性的酶蛋白。Klinc将酶水解产生的Pi透析到还原性试剂中,以进行Na~ -K~ -ATPase的自动分析。Arnold用表面活性剂溶解膜蛋白,省去过滤、离心或透析等步骤,进行膜ATPase的自动分析,具有简便、快速、灵敏度高、结果可靠等特点,本文基于Arnold的工作,全部使用国产仪器,用于红细胞膜Ca~(2 )Mg~(2 )-ATPase的分析。材料与方法 1、试剂 ATP(江门化工厂),Ouabain为Serva公司产品,其余均为国产分析纯试剂。     

血源细胞系中CD39的表达和功能分析

细胞外ATP通过激活细胞膜上核苷酸受体介导细胞间通讯。CD39是一个钙,镁离子依赖的ATP双磷酸酶,其对ATP信号的调节机制尚未完全阐明。采用半定量RT．PCR、ABC免疫酶标和流式细胞术以及荧光素／荧光素酶法,研究了七个血源细胞系中CD39的表达和功能。结果表明,不同细胞中CD39的表达水平差异显著：在J6-1和LCL-H中高水平表达,在HL60中低水平表达,而在Namalva、Jurkat,U937细胞中极低水平表达．CD39的表达与这些细胞膜上ATP酶活性、胞外ATP的基础水平结果一致,提示CD39是这些细胞膜上ATP酶活性的主要来源,可能在调节P2受体介导的细胞间通讯中起重要作用。     

从叶片中提取ATP方法的比较

根据前人和我们的工作结果研制的发光光度计和荧光素酶测ATP的技术在固氮,光合作用,植物激素,海洋生物量,植物种子,医学等研究领域中得到了广泛地应用,除了顾增辉等从植物种子提取ATP以外,而关于该技术的方法学研究则不多。目前一般都采用组织破碎法从叶中提取ATP,但这种方法存在一些缺     

三磷酸腺苷发光法快速检测结核分枝杆菌药敏技术的研究

目的 建立一种利用三磷酸腺苷( ATP) 与荧光素酶反应测定结核分枝杆菌( 简称结核杆菌) 释放的ATP 来判断结核杆菌药敏的技术。方法 ATP 生物发光法( 简称ATP 法) 通过裂解液体培养基中的结核杆菌, 释放活菌中的ATP, 加入荧光素酶使之发光以检测结核杆菌的活性。共采用H37Rv 标准株和10 株临床分离菌株, 用ATP 法与BACTEC 3D 法同步平行进行利福平药敏检测, 连续7 d 检测结核杆菌释放的ATP, 观察其生长曲线, 并以此判断对药物的敏感性。结果 在生长5 ～7 d的培养基中ATP法可以检测到敏感菌释放的ATP, 并且显著高于耐药菌所释放的ATP, 通过与BACTEC 3D 法相比确定其判断药敏的临界值, 检测结果与L-J 法及同步平行的BACTEC 3D 法对照组符合率达100% 。结论 ATP法可用于结核杆菌对抗结核药物敏感性的检测, 且因其价格较低, 无放射性元素的存在, 作为一种新型的结核杆菌药敏检测技术具有巨大的临床应用潜力。     

基于ATP生物发光法的微生物数量快速检测技术的研究进展

微生物数量的快速检测一直是工业生产与食品行业需要解决的问题,腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)生物发光法具有操作简便、检测周期短等优点,可满足一般微生物检测的需求。然而,ATP生物发光法的准确性也受到不同因素的影响,如微生物的ATP检测限值较高、微生物自身及其他因素(如非微生物ATP、提取剂种类、荧光素酶活性等)均对微生物数量的检测产生影响。本文简述了不同微生物数量检测方法的优缺点,介绍了ATP生物发光法的发展历程及原理,综述了非微生物ATP与游离ATP、微生物量、ATP提取剂、荧光素酶等因素对ATP生物发光法灵敏度与稳定性的影响,归纳总结了ATP生物发光法及检测设备在食品、医疗、污水处理等领域的应用现状,并就ATP生物发光法体系的优化及ATP在线检测的应用等方面进行了展望,以期为ATP生物发光法的高效应用提供新的思路。     

荧光素酶可能是有用的工具

经遗传工程的烟草植株,由于在黑暗中能发光而呈现出美丽的图象。这项成就对于想知道植物或动物细胞什么时候进行基因表达的研究人员来说,其价值是不能低估的。Sun Diego加利福尼亚大学的Stephen H.Howell及其同事用Ti质粒将萤火虫荧光素酶基因转移到烟草植株细胞中,这些细胞的再生植株把荧光素酶基因传给了它们的后代。若把虫荧光素供给转化植株,(虫荧光素是在萤火虫里发现的另一物质)则在荧光素酶基因表达荧光素酶之