培养心肌细胞肾上腺素能受体的研究

自1960年Harary用胰酶消化分散新生大鼠单个心肌细胞培养成功以后,其他学者相继培养成功大鼠胎鼠和人胚分散心肌细胞。我国学者参照Harary的方法于1981年培养大鼠乳鼠单个心肌细胞成功,有的学者还于1983年观察了β受体药物异丙肾上腺素和心得安对心肌细胞搏动频率的影响。 为了研究单个心肌细胞和其它细胞混合培养时,心肌细胞和其它细胞形态分化和化学分化     

成年大鼠心肌细胞分离和培养相关研究进展

心肌细胞已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具,是在体心肌模型的重要补充。但是大多数研究用的细胞都来自培养的新生鼠的未成熟心肌细胞,未成熟心肌细胞与成年鼠心肌细胞在形态、结构、功能上存在很大的差异,其实验结论难于推论于成熟心肌细胞。相较于未成熟心肌细胞,成熟心肌细胞的分离和培养相对困难但更有研究价值,怎么分离出高质量的成熟心肌细胞并使其长时间保持活性就成为关键问题。所以,本文将对成年大鼠心肌细胞分离和培养的相关研究进展进行综述。     

成年大鼠心肌细胞分离培养及兴奋-收缩耦联表征

目的：比较两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,进一步表征成年大鼠心室肌细胞兴奋-收缩耦联。方法 Langendorff装置进行主动脉逆流灌流,分别用两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,无血清培养并进行腺病毒感染。显微镜下观察单个心肌细胞的形态学特点,荧光显微镜下检测病毒感染。采用IonOptix仪器检测心肌细胞肌节收缩-舒张指标以及心肌细胞钙离子摄入-排出指标。结果两种分离液均可获得70％横纹清晰的长杆状心肌细胞,培养可存活7 d以上。腺病毒感染48 h,绿色荧光蛋白持续表达7 d以上。分离液一获得的心肌细胞不能很好地随电场刺激产生收缩,分离液二获得的细胞可用于检测兴奋-收缩耦联特性,心肌细胞肌节缩短分数为11.61％±2.15％,舒张时间为（0.177±0.031） s,钙瞬变幅度为30.79％±9.74％,钙瞬变衰减时间为（0.300±0.074） s。结论两种分离液均可用于分离和培养成年大鼠心肌细胞,并用于腺病毒转染等长时程研究。分离液二更适用于检测成年大鼠心肌细胞的兴奋-收缩耦联特性。     

一氧化氮抑制血管紧张素Ⅱ和内皮素—1诱导的心肌细胞原癌基因c—fo …

在原代培养的新生大鼠心肌细胞上,探讨一氧化氮（ＮＯ）对血管紧张素Ⅱ（ＡⅡ）和内皮素－１（ＥＴ－１）诱导的心肌细胞肥大和原癌基因ｃ－ｆｏｓ表达的影响。用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定心肌细胞总蛋白含量（作为心肌细胞肥大的指标）;用基因特异性引物和ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ一步法进行逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,检测大鼠心肌细胞原癌基因ｃ－ｆｏｓ的表达（以ＧＡＰＤＨ为内标）。结果显示,ＡⅡ和ＥＴ－１分别作     

机械性刺激对体外培养心肌细胞形态的影响

体外培养新生大鼠心肌细胞于硅胶片上,进行周期性、机械性刺激,观察物理刺激对心 肌细胞形态的影响。结果表明,当用10％幅度拉长、松弛硅胶片,10周期/分,进行72小时机械性运动后,心肌细胞发生形态改变,其细胞内肌动蛋白垂直于运动方向,说明机械性刺激能影响体外培养心肌细胞形态。     

培养成年大鼠心肌细胞存活的形态标志

目的：通过探寻增加培养成年大鼠心肌细胞存活率以及防止再分化的方法,揭示培养成年大鼠心肌细胞存活的形态标志。方法：采用Langendorff系统灌流心脏,胶原酶消化法分离成年大鼠心肌细胞,分3组进行细胞培养：①基础培养液＋凋亡抑制剂;②基础培养液＋5%胎牛血清;③基础培养液＋5%胎牛血清＋凋亡抑制剂。结果：①培养前3天杆状心肌细胞比例逐渐降低,无血清培养组比血清培养组降低程度大。培养前3天凋亡率逐渐升高,无血清培养组比血清培养组凋亡率高,加入凋亡抑制剂对凋亡率无影响。②有血清培养2~3天的成年大鼠心肌细胞闰盘部位伸出伪足,促使细胞贴壁生长;当培养至第6天时,细胞侧面也伸展出贴壁的伪足,细胞丧失杆状形态,横纹消失。而无血清培养的细胞无伪足生成,随着培养时间增加,细胞末端变圆钝,横纹变模糊。凋亡抑制剂对伪足形成率无影响。③培养存活的成年大鼠心肌细胞骨架重排,发生再分化。④血清培养组细胞胞内核间距离随着培养时间的增加而减小,无血清培养组则保持不变。结论：成年大鼠心肌细胞培养至第2~3天时,闰盘部位形成伪足是细胞存活的形态标志,加入血清是伪足形成的必要条件。     

小剂量过氧化氢对大鼠心肌细胞钙瞬变及凋亡的作用

目的:探讨小剂量过氧化氢导致的氧化应激对大鼠心肌细胞钙瞬变及细胞凋亡的作用。方法:解剖取出成年大鼠心脏,应用langendorff方法分离心肌细胞,加入fluo-3荧光指示剂后,应用不同浓度的过氧化氢作用于心肌细胞,在共聚焦显微镜下测定心肌细胞内钙瞬变。分离并培养新生大鼠心肌细胞,观察过氧化氢处理心肌细胞后其形态的变化,从而评价小剂量过氧化氢对心肌细胞的凋亡作用。结果:应用0.125 mmol/L、0.25 mmol/L及0.375 mmol/L的过氧化氢作用于心肌细胞后,心肌细胞内钙瞬变幅度明显升高,并呈时间剂量依赖性。在培养的大鼠原代心肌细胞中加入0.25 mmol/L的过氧化氢后,心肌细胞发生凋亡的形态变化。结论:小剂量过氧化氢可开放心肌细胞L-钙通道,明显增加心肌细胞内钙瞬变,并导致心肌细胞凋亡。     

细胞外基质对体外培养心肌细胞铺展作用的影响

本研究用分离的新生大鼠心肌细胞,观察不同的细胞外基质,在培养不同时间对心肌细胞铺展的影响。结果表明,不同的细胞外基质影响心肌细胞铺展,在培养8小时即出现差别,48小时差异明显,其中FN促进心肌细胞铺展,而FN的片段延缓心肌细胞的铺展。     

细胞周期素D在培养的新生大鼠心肌细胞中的表达

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,研究心肌细胞中细胞周期素D表达的变化规律.方法心肌细胞分离、纯化及培养后用倒置显微镜观察其形态变化,免疫细胞化学染色及图像分析方法检测培养第1～21天新生大鼠心室肌细胞周期素D的表达.结果心肌细胞核内细胞周期素D表达量逐渐下降,第2天与第1天比较,差异无显著性(P>0.05),从第3天开始差异有显著性(P<0.05,P<0.01).结论新生大鼠心肌细胞出生后早期体外培养的前3天有一定增殖能力,但以后呈下降趋势.     

创伤早期激活的caspase-12引起心肌细胞凋亡及继发性心脏损伤（英文）

创伤引起的继发性心脏损伤(trauma-induced secondary cardiac injury,TISCI)是创伤致死的重要原因。本研究组前期研究观察到创伤可以导致心肌细胞凋亡和继发性心功能受损,但具体机制不清。本研究旨在观察创伤时心肌细胞凋亡发生的时间规律,并探讨创伤导致心肌细胞凋亡的可能途径。采用Noble-Collip鼓制备创伤大鼠模型;利用创伤后血清培养正常大鼠心肌细胞48 h。在不同时间点检测心肌细胞凋亡、心脏功能及凋亡相关蛋白酶caspase-3、-8、-9和-12。结果显示,继发性心功能受损出现在创伤后24 h,而创伤大鼠心肌凋亡指数和caspase-3活性均在创伤后6 h就显著增加,12 h达峰值。大鼠心肌组织caspase-12(介导内质网应激反应性凋亡途径)活性和表达在创伤后3 h出现明显升高,6 h达峰值;而心肌组织caspase-8(介导外源性凋亡途径)和caspase-9(介导内源性凋亡途径)均于创伤后24 h激活。同时,采用创伤血清培养正常大鼠心肌细胞,结果同样显示,创伤血清可以引起正常大鼠心肌细胞caspase-3活性显著增加,且心肌细胞caspase-12的活化早于caspase-3、-8和-9的激活;给予caspase-12特异性抑制剂Z-ATAD-FMK处理后,创伤血清引起的心肌细胞凋亡显著降低。此外,创伤后6 h心肌组织caspase-12活性的增高与创伤后24 h继发性心功能减低呈现显著的负相关。本研究表明,在TISCI时caspase-12最早激活,且激活的caspase-12是创伤所致心肌细胞凋亡的重要原因,因此抑制caspase-12介导的细胞凋亡有望成为减轻TISCI的新举措。     

模拟微重力条件下心肌细胞的体外三维固定化培养

观察心肌细胞体外培养形成三维(3D)组织结构的能力和过程及心肌细胞在模拟微重力状态下的3D固定化培养效果。应用酶消化法从新生的乳鼠心室肌组织获取心肌细胞,以Cytodex3为心肌细胞的3D固定化培养载体,将心肌细胞固定化培养于Spinnerflask中,用扫描电镜观察心肌细胞体外培养形成的3D组织结构;以心肌细胞的代谢效率和细胞搏动强度为观察指标,比较心肌细胞在Spinnerflask及HARV(highaspectratevessel)生物反应器中3D固定化培养的差异。结果显示,心肌细胞不仅能贴附于Cytodex3上生长,且形成了具有同步自律收缩的3D组织样结构;心肌细胞在两种不同培养体系中的细胞接种效率和细胞形态没有明显差异,培养于HARV中的心肌细胞的代谢效率和细胞搏动强度均明显高于Spinnerflask培养体系。体外培养的乳鼠心肌细胞具有形成同步自律收缩的3D组织结构的能力;模拟微重力的培养环境有利于改善心肌细胞3D组织样培养物的代谢和功能 。     

黄芪对培养的大鼠搏动心肌细胞感染柯萨奇B_2病毒后保护作用的超微观察

前文已经报道应用电子显微镜观察到培养的新生大鼠搏动心肌细胞感染柯萨奇B_2病毒后,细胞超微结构有明显病变,而中药黄芪对柯萨奇B_2病毒感染培养的大鼠心肌细胞所致心肌酶-乳酸脱氢酶及谷草转氨酶的释放,细胞搏动的停止等均有保护作用(待发表资料)。本     

转化生长因子β1对大鼠心肌细胞肥大的影响

目的：研究转化生长因子β1（TGF-β1）及其下游Smad3信号蛋白在大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法：TGF-β1干预培养新生大鼠心肌细胞,流式细胞仪检测心肌细胞总蛋白含量。结扎大鼠腹主动脉复制心肌肥厚模型,在不同时间点处死动物,检测左室质量指数（LVM1）,RT—PCR检测TGF-β1及Smad3的mRNA表达,Westernblot检测Smad3蛋白的表达。结果：不同剂量TGF-β1均能明显增加体外培养的心肌细胞总蛋白含量,TGF-β1（3ng／ml）还增加心肌细胞Smad3 mRNA和蛋白的表达,其表达量1h达高峰,持续至TGF-β1刺激后8h。大鼠腹主动脉结扎术后3d LVMI开始上升并持续至术后28d,心肌组织中TGF-β1、Smad3的mRNA表达水平以及Smad3蛋白表达术后3d也开始上升持续至术后28d,术后14d为表达高峰（P〈0．01）。结论：TGF-β1能诱导大鼠心肌细胞肥大,其信号蛋白Smad3参与了大鼠心肌肥大的病理过程。     

诱导体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

选用Wistar大鼠分离骨髓间充质干细胞作体外培养及鉴定其表达抗原CD44、CDw90;采用10μmol／L 5-氮胞苷诱导第1代的骨髓间充质干细胞,于诱导后2、4周进行免疫细胞化学反应检测α-横纹肌肌动蛋白、肌钙蛋白T。证实体外培养的第1代骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导可分化为心肌样细胞,为指导体外诱导的心肌细胞应用于。临床提供一定的理论依据和技术手段。     

增加Gi和β2AR表达对异丙肾上腺素损伤的大鼠心肌细胞存活的影响

目的：观察增加β2肾上腺素受体（β2AR）和抑制性G蛋白（Gi）基因的表达是否可改善长期异丙肾上腺素（ISO）刺激引起的心肌细胞死亡。方法：用腺病毒作载体,在培养的心肌细胞增加β2AR和Gi基因的表达;然后在培养基中加入5μmol/L的异丙肾上腺素以损伤心肌细胞,24h后记数各组细胞的存活率。结果：β2AR和Gi表达增加,对正常培养的大鼠心肌细胞的死亡率均没有影响,但能够减少异丙肾上腺素损伤引起的细胞死亡。这种作用可分别被β2AR选择性阻断剂ICI118,551和Gi阻断剂百日咳毒素（PTX）所阻断。结论：增加β2AR或Gi基因的表达,对异丙肾上腺素损伤的心肌细胞有保护作用。     

一氧化氮在血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大中的作用

在培养新生大鼠心肌细胞上,探讨一氧化氮（ＮＯ）在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞以大中的作用。结果显示,血管紧张素Ⅱ可使心肌细胞蛋白质含量显著增加,心肌细胞一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活性和培养液ＮＯ浓度明显降低。血管紧张素Ⅱ可明显降低心肌细胞ｅＮＯＳｍＲＮＡ水平。Ｓａｒａｌｓｉｎ和百日咳毒素（ＰＴＸ）可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的蛋白质含量增加、心肌细胞ＮＯＳ活性减弱和培养液ＮＯ浓度降低。硝普钠提高心肌细胞培养     

β_1-肾上腺素受体表达的增加未能保护异丙肾上腺素损伤的大鼠心肌细胞

本文旨在观察转染β1-肾上腺素受体(β1-adrenoceptor,β1-AR)基因对异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)损伤的大鼠心肌细胞收缩功能和存活的影响。采用胶原酶消化法分离培养原代大鼠心肌细胞,转染含β1-AR基因的腺病毒后,用ISO孵育24h致心肌细胞损伤,采用Westernblot检测心肌细胞β1-AR蛋白的含量,通过计数培养细胞中杆状细胞的百分率来检测心肌细胞存活率,用可视化边缘探测系统检测心肌细胞收缩功能变化。结果显示,与对照组相比,转染β1-AR基因的心肌细胞β1-AR蛋白含量明显增加(P0.01);转染β1-AR基因并用ISO损伤的心肌细胞内β1-AR蛋白含量亦明显增加(P0.01)。与对照组相比,转染β1-AR基因的心肌细胞存活率没有明显变化,ISO损伤的心肌细胞存活率明显下降(P0.01);而转染β1-AR基因并用ISO损伤的心肌细胞存活率与ISO组比进一步下降(P0.01)。与对照组相比,转染β1-AR基因的心肌细胞收缩幅度显著增大(P0.05),ISO损伤的心肌细胞收缩幅度明显下降(P0.01);而转染β1-AR基因并用ISO损伤的心肌细胞的收缩幅度与ISO组比没有明显变化。以上结果提示,β1-AR的表达增加对ISO损伤的大鼠心肌细胞的保护作用不明显。     

血管钠肽对中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成有抑制作用

实验探讨了心房钠尿肽家族新成员血管钠肽（vasonatrin peptide,VNP)对中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成的影响,在培养的新生大鼠心肌细胞上,用四唑盐（MTT）比色实验,总蛋白含量测定和^3H-亮氨酸掺入实验等方法观察细胞数和蛋白合成情况,并用放免法测定VNP对细胞内环鸟苷酸（cGMP)和环腺苷酸（cAMP)以及培养上清液中内皮素含理的影响,探讨VNP的作用机制,结果显示,重度低氧24h,心肌细胞数和蛋白合成均降低,而中度低氧显著增加蛋白的合成,具有促心肌细胞肥大的作用,VNP浓度依赖性地抑制中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成增加,并且升高细胞内cGMP水平,降低低氧诱导的培养上清液中内皮素的含量,结果提示,VNP抑制中度低氧诱导的新生大鼠心肌细胞蛋白合成增加,该作用与其升高细胞内cGMP浓度、降低低氧诱导的内皮素合成和/或释放增加有关。     

血清饥饿条件下δ阿片受体激活对心肌细胞存活的影响

目的:研究血清饥饿对心肌造成损伤过程中,δ阿片受体激活是否对心肌细胞的存活起保护作用.方法:体外原代培养乳大鼠心肌细胞.结晶紫法测定心肌细胞活力;流式细胞仪检测细胞周期S G2 M百分比;流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡指数; Western蛋白印迹法检测心肌细胞胞浆内caspase-3蛋白表达.结果:体外原代培养乳大鼠心肌细胞经无血清培养48小时后,心肌细胞出现明显的凋亡,caspase-3表达增加;当给予不同浓度的δ阿片受体激动剂[D-Ala2,D-Leu5]脑啡肽(DADLE)作用于心肌细胞后,能明显抑制心肌细胞凋亡,并且0.1 μmol·L-1DADLE的作用最为显著,表现为,心肌细胞活力增加,心肌细胞的 S G2 M百分比升高;心肌细胞的凋亡指数下降,caspase-3蛋白表达降低; 0.1 μmol·L-1DADLE对心肌细胞的保护作用能被δ阿片受体拮抗剂naltrindole 10μmol·L-1完全阻断,表现为,心肌细胞活力降低,心肌细胞的凋亡指数升高;心肌细胞的 S G2 M百分比降低;caspase-3的蛋白表达明显升高;说明DADLE通过激活δ阿片受体对心肌细胞起保护作用.结论:在血清饥饿条件下,δ阿片受体激活对心肌细胞的存活有保护作用.     

siRNA对神经肽Y诱导的大鼠心肌细胞肥大Ca2+/CaM-CaN通路的影响

采用差速贴壁法体外原代培养大鼠心肌细胞;NPY刺激培养的心肌细胞增殖;RNA干涉特异性抑制CaN的活性,阻断NPY刺激的心肌细胞中Ca2 /CaM-CaN信号转导通路;观察对CaN活性、表达水平和心肌细胞蛋白合成速率的变化.实验结果显示NPY可增加心肌细胞的CaN活性和表达,加快细胞内蛋白合成速率.RNA干涉抑制CaN活性后,明显降低NPY刺激的蛋白合成速率.CaN参与了NPY刺激的心肌细胞增殖,RNA干涉通过抑制CaN的活性可阻断N PY诱导的心肌细胞肥大Ca2 /CaM-CaN通路.