利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比

为了评价重组大肠杆菌表达的HPV16L1蛋白和重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP两种抗原在检测宫颈癌抗 16L1或VLP抗体及在宫颈癌血清学诊断意义上的差别 ,应用PCR技术从宫颈癌组织的DNA中扩增出全长15 35bp的HPV16L1基因片段 ,克隆至 pUC18 T载体中 ,进行DNA测序鉴定。然后 ,将HPV16L1基因克隆至pGEX 2T表达载体中 ,并诱导表达HPV16L1融合蛋白 ,分子量为 83kD ,能被HPV16L1单克隆抗体所识别。经GST柱层析法纯化后 ,与重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP分别经酶联免疫吸附 (ELISA)法检测 12份宫颈癌患者和 35份献血员血清。 12例宫颈癌血清标本中 ,抗HPV16L1蛋白的抗体阳性率为 7例 (占 5 8.3% ) ;抗HPV16L1 VLP的抗体阳性率为 8例 (占 6 6 .7% )。经大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1检测为HPV16抗体IgG( )的 7份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测均阳性 ;经大肠杆菌表达的重组抗原检测为HPV16抗体IgG( )的 5份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测有 1份阳性。两者对HPV16抗体的阳性检出率并无显著差异 (P >0 .0 5 )。本实验结果说明HPV16与宫颈癌高度相关 ,利用大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1和HPV16L1 VLP重组抗原检测抗体的敏感性并不受影响。利用重组抗原HPV16L1对宫颈癌的抗体进行定性、定量分析有助于该疾病     

粗提和纯化的HPV16L1重组蛋白为抗原的ELISA比较

为评价真核及原核细胞表达的HPV16L1粗提蛋白代替纯化的16L1蛋白作为ELISA检测抗原的可行性。实验分别用大肠埃希菌表达的HPV16L1纯化蛋白,表达16L1的大肠埃希菌破碎物及表达16L1的昆虫细胞破碎物作为抗原。在ELISA试验中与抗HPV16L1的单克隆抗体进行反应。结果证实3种包被抗原可以得出非常相近的OD值变化趋势。表明用表达16L1的大肠埃希菌破碎物和表达16L1的昆虫细胞破碎物可以代替纯化的HPV16L1蛋白作为抗原进行ELISA试验。     

HPV16L1VLP纯化、鉴定及血凝抑制实验方法的建立

摘要通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达HPV16L1 VLP,纯化鉴定后利用其建立血凝抑制实验,检测HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。利用重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞表达HPV16L1蛋白,大量获得VLP;优化扩增蛋白的条件并用SDS-PAGE分析鉴定;经氯化铯密度梯度离心法纯化VLP;利用所得VLP建立血凝抑制试验,鉴定制备的HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。优化蛋白表达条件结果显示,当重组杆状病毒感染细胞的MOI=10时目的蛋白表达量最大;按此滴度感染悬浮培养的昆虫细胞,收获、纯化VLP并鉴定其特异性;利用所得VLP建立了血凝抑制实验,鉴定HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制效价为1∶16。建立的血凝实验,可用于鉴定和检测HPV16L1相关抗体,为HPV诊断试剂的开发提供实验基础。     

柯萨奇病毒A组16型衣壳蛋白VP1的原核表达及初步活性测定

目的:原核表达柯萨奇病毒A组16型(CVA16)衣壳蛋白VP1,以便于研制血清学检测试剂。方法:在基因库中钓取CVA16-VP1的全长序列,采用PCR逐步合成法合成其全长基因,测序正确后克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化;建立捕获免疫酶联法检测IgM抗体,检测20份手足口病阳性血清和30份阴性血清,评价重组抗原的灵敏度和特异性;采用CVA16全病毒免疫的抗小鼠血清进行Western印迹。结果:重组CVA16-VP1蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;用重组蛋白抗原检测,20份手足口病患儿阳性血清中有4份阳性,其中1份同时为肠道病毒71型(EV71)VP1阳性,30份阴性血清无反应。结论:实现了CVA16-VP1的高效表达,初步结果显示重组蛋白具有较好的抗原性,为柯萨奇病毒A组16型诊断试剂的研究奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白的克隆及表达

采用PCR技术从宫颈癌组织中扩增人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type16,HPV16)L1全长基因片段,目的片段克隆到pMD18T载体后经酶切鉴定及测序确认。构建重组原核表达质粒pGEX4T1-L1,转化大肠杆菌E.coliBL21,IPTG诱导表达出以非可溶性蛋白形式存在的表达蛋白,该重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的17%,免疫印迹检测表明,表达蛋白与宫颈癌病人血清出现特异性反应。成功构建了重组原核表达质粒pGEX4T1-L1,并且在原核细胞中得到表达,为进一步研究L1蛋白的免疫学活性及疫苗的研发奠定了基础。     

弓形虫优势表位融合于HPV16L1“N端”的融合体可显著提高表位免疫反应性

弓形虫和人乳头瘤病毒 (HPV) 具有共同的免疫保护人群,选择HPV16型晚期结构蛋白1 (HPV16L1) 为载体,携带弓形虫多表位 (RSepitope) 以期提高表位免疫原性同时可实现共免疫效应。文中分别以构建的融合体RSepitope-HPV16L1 (RSepitope融合于HPV16L1“N”端)以及HPV16L1-RSepitope (RSepitope融合于HPV16L1“C”端),脂质体转染COS-7细胞后,RSepitope-HPV16L1融合体形式可以在转染细胞中得到有效转录和翻译,分别可检测到相应的RSepitope和HPV16L1的mRNA和蛋白,但HPV16L1-RSepitope融合体形式在转染细胞中检测不到目标抗原的mRNA和蛋白。融合体采用“DNA初免-蛋白质加强免疫”的方案免疫BALB/c小鼠,酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和酶联免疫斑点试验 (ELISPOT) 分别检测到RSepitope-HPV16L1免疫鼠血清中显著升高的体液和细胞免疫反应 (即最高水平的RSepitope特异性抗体IgG和IFN-γ),且比较单独RSepitope免疫组 (不与HPV16L1融合),产生的是显著升高的Th1和Th2免疫反应类型,提示HPV16L1作为表位载体的优势效应。而HPV16L1-RSepitope融合体形式体内也未能诱导有效的免疫反应。以上研究提示,HPV16L1“N”端可能是较为合适的表位融合位置,融合体表位特异性免疫学效应显著提高,研究结果为提高表位疫苗的免疫原性提供了一个合理的载体融合策略。     

HPV16L1抗原表达肿瘤模型的建立

应用基因重组技术,构建pcDNA-L1真核表达载体,经限制性内切酶和序列分析,用脂质体转染技术将其转入B16细胞,G418稳定筛选后IFA法检测其表达,RT-PCR法检测HPV16L1 mRNA 的生成,并将转染细胞接种小鼠皮下,观察成瘤情况及RT-PCR法检测HPv16L1 mRNA的生成。结果,酶切鉴定证实重组质粒中插入的目的基因片段及载体大小、方向和插入位点均正确,在转染的 B16细胞中可见绿色荧光并检测到HPV16L1 mRNA的生成,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤, 接种后1月在肿瘤组织中可检测到HPV16L1 mRNA的生成,B16细胞转染L1后其致瘤性与转染空载体组和野生型B16细胞组无明显差异。     

表达HPV16 L1抗原的1型重组AAV载体免疫效果的研究

为研究1型重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus type 1,AAV1)载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建含密码子优化型HPV16L1基因(mod.HPV16L1)的1型重组AAV载体rAAV1-mod.HPV16L1,将纯化的rAAV1-mod.HPV16L1以肌注和滴鼻途径分别免疫C57BL/6小鼠,使用体外中和实验检测血清中的特异性中和抗体.结果显示,rAAV1-mod.HPV16L1单针肌注及滴鼻免疫均可诱导特异性血清中和抗体,但二组抗体动态变化趋势不同,肌注组血清中和抗体滴度显著高于滴鼻组.rAAV1-mod.HPV16L1单针肌注免疫可诱导强而持久的血清中和抗体,是理想的候选HPV16预防性疫苗.     

HPV16L1晚期基因阳性表达重组菌株的筛选

HPV16与宫颈癌的发生发展关系密切。其基因功能区包括早期区（E区）、晚期区（L区）及调节区。E区与细胞转化、致癌有关;L区分为L1和L2,L1区主要编码病毒衣壳蛋白,表达的蛋白能刺激机体产生保护性抗体,因此通过对HPV16L1基因的克隆及表达,可为制备基因工程疫苗和诊断试剂盒打基础。本实验通过甲醇诱导培养法及SDS－PAGE电泳对本室已立了HPV16L1－ρPIC3．5／GS115重组菌株进行了筛选,获得了1株HPV16L1晚期基因的GS115酵母菌重组表达株,所表达的蛋白质分子量为80KD。与预计相同,并证明第3天时L1蛋白的表达量最大。     

腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16 L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配

为研究重组腺病毒载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究。首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16 L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod.HPV16L1。将mod.HPV16L1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1。用免疫印迹法检测病毒感染的293T细胞中HPV16L1蛋白的表达。通过Optiprep密度梯度超速离心法纯化HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs)。用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HPV16 L1蛋白自我装配形成的VLPs。结果显示,重组腺病毒载体可介导mod.HPV16 L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L1蛋白可自我装配形成VLPs。     

密码子优化型HPV16L1基因在两种昆虫细胞中的表达

目的:提高16型人乳头瘤病毒（HPV16）L1基因在杆状病毒昆虫细胞中的表达水平,为研制预防性HPV疫苗奠定基础。方法:根据昆虫细胞密码子偏性对野生型HPV16L1基因进行改造,利用Bac-to-Bac表达系统获得重组杆状病毒,感染昆虫细胞Sf9和High Five。Western blot鉴定表达产物;电镜下观察病毒样颗粒形成。利用ELISA法评价HPV16L1基因的优化效果,探讨L1蛋白表达的最佳条件。结果:在相对分子质量56kDa处出现HPV16L1的特异性条带;电镜下可见病毒样颗粒在昆虫细胞的核内形成;优化型HPV16L1基因的表达水平显著高于野生型。High Five细胞表达的最佳条件为MOI=10,表达时相72h,其L1蛋白表达量至少比Sf9细胞高3倍。结论:密码子优化技术确实能够促进HPV16L1蛋白的高效表达,而High Five细胞表现出的显著优势尤其值得关注。     

Dynamic response of HPV16/anti-HPV16 pairs with unbinding events studied by atomic force microscopy

This paper proposes an effective approach to distinguish whether samples include Human Papilloma virus type-16 (HPV16) by Atomic force microscopy (AFM). AFM is an important instrument in nanobiotechnology field. At first we identified the HPV16 by Polymerase chain reaction (PCR) analysis and Western blotting from specimen of the HPV patient (E12) and the normal (C2), and then we used an AFM to observe the surface ultrastructure by tapping mode and to measure the unbinding force between HPV16 coupled to an AFM tip and anti-HPV16 L1 coated on the substrate surface by contact mode. The experimental results by tapping mode show that the size of a single HPV viron was similar to its SEM image from the previous literatures; moreover, based on the purposed methods and the analysis, two obvious findings that we can determine whether or not the subject is a HPV patient can be derived from the results; one is based on the distribution of unbinding forces, and the other is based on the distribution of the stiffness. Furthermore, the proposed method could be a useful technique for further investigating the potential role among subtypes of HPVs in the oncogenesis of human cervical cancer.     

Stable high-level expression of truncated human papillomavirus type 16 L1 protein in Drosophila Schneider-2 cells

To improve the existing human papillomavirus type 16 (HPV16) virus-like particle (VLP) preparation, the Drosophila inducible/secreted expression system, a highly efficient, economical method, was used to produce HPV16 VLPs. Drosophila Schneider-2 cells were cotransfected with pMT/BiP/V5-His expression vector containing the target gene encoding HPV16L1 protein without nucleus localization sequence and the selection vector pCoHygro plasmids at the ratio of 4:1. The stabled hygromycin-resistant cell line was obtained 1 month later, and the protein expression was induced by copper sulfate. The molecular mass of expressed HPV16L1 protein was 66 kDa, as revealed by SDS-PAGE, and confirmed by Western blot analysis. The yield of HPV16L1 protein was 0.554 mg per 1×10⁷ cells. The characteristics of HPV16L1 protein were further analyzed by mouse erythrocyte hemagglutination assay, hemagglutination inhibition assay, and transmission electron microscopy. Results showed that the truncated protein was as biologically active as natural HPVL1 protein, inducing murine erythrocyte agglutination and VLP formation. These findings indicate that the Drosophila inducible/secreted expression system is promising as a convenient and economical method for the preparation of HPV16VLP vaccine.     

人乳头瘤病毒16型L1基因在毕赤酵母中表达的影响因素分析

目的:优化人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1(human papillomavirus type 16 major capsid protein L1,HPV16L1)在毕赤酵母中的表达,并考察可能的影响因素。方法:四个不同序列特征的HPV16L1基因M16、Y16、P16、W16(其中,M16和Y16按酵母密码子优化,P16为哺乳动物细胞密码子优化,而W16为野生型序列)分别克隆于毕赤酵母表达质粒p PinkTM-HC(高基因拷贝菌落筛选)和p PinkTM-LC(低基因拷贝菌落筛选),并转化不同蛋白酶缺陷的宿主菌。甲醇诱导24小时后,取菌体样品经Western blot分析L1蛋白的表达。结果:M16显示了最高的表达水平,其次是Y16与P16,而W16几乎无表达。基因序列密码子应用特征分析显示,4个基因的密码子适应指数从高到低依次为Y16、M16、W16和P16。通过自由能和GC含量分析4个序列的mRNA二级结构,Y16为-409.40 kcal/mol和43.85%;M16为-451.50 kcal/mol和47.83%;P 16为-606.50kcal/mol and 64.10%;W16为-384.70 kcal/mol and 38.01%。蛋白酶缺陷菌株L1表达高于野生型菌株,质粒p PinkTM-HC与p PinkTM-LC介导的表达无明显区别。结论:密码子优化操作显著改善了HPV16L1在毕赤酵母中的表达,但表达水平与密码子利用优劣并不完全对应,提示密码子优化仅是部分原因,而mRNA结构与稳定性变化值得探讨。蛋白酶缺陷菌株提高了HPV16L1蛋白的稳定性,显著影响了表达水平。研究证明基因剂量对HPV16L1的表达未产生明显影响。     

HPV18晚期蛋白L1在毕赤酵母菌中的表达及鉴定

目的:用毕赤酵母胞内表达载体构建含人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1基因质粒,诱导表达并进行鉴定。方法:按照毕赤酵母密码子偏爱性原则,合成全长L1基因,然后克隆到pAO819表达载体上,在体外分别构建含一个拷贝和二个拷贝的L1基因载体。线形化后转化到GS115酵母细胞,经G418抗性筛选,获高拷贝重组子并经甲醇诱导表达,表达产物采用化学发光Western blot鉴定,一抗为抗HPV18L1蛋白鼠抗血清。结果:在55kDa处有诱导蛋白免疫印迹出现,并在电镜下观察到HPV18的病毒样颗粒(VLPs),证明该表达系统能表达出HPV18 L1蛋白。结论:本实验构建的毕赤酵母表达菌株,可经甲醇诱导表达HPV18L1晚期蛋白,为进一步研制人乳头瘤病毒18型基因工程疫苗打下基础。     

Immunogenic assessment of plant‐produced human papillomavirus type 16 L1/L2 chimaeras

Cervical cancer is caused by infection with human papillomaviruses (HPV) and is a global concern, particularly in developing countries, which have ~80% of the burden. HPV L1 virus‐like particle (VLP) type–restricted vaccines prevent new infections and associated disease. However, their high cost has limited their application, and cytological screening programmes are still required to detect malignant lesions associated with the nonvaccine types. Thus, there is an urgent need for cheap second‐generation HPV vaccines that protect against multiple types. The objective of this study was to express novel HPV‐16 L1‐based chimaeras, containing cross‐protective epitopes from the L2 minor capsid protein, in tobacco plants. These L1/L2 chimaeras contained epitope sequences derived from HPV‐16 L2 amino acid 108–120, 56–81 or 17–36 substituted into the C‐terminal helix 4 (h4) region of L1 from amino acid 414. All chimaeras were expressed in Nicotiana benthamiana via an Agrobacterium‐mediated transient system and targeted to chloroplasts. The chimaeras were highly expressed with yields of ~1.2 g/kg plant tissue; however, they assembled differently, indicating that the length and nature of the L2 epitope affect VLP assembly. The chimaera containing L2 amino acids 108–120 was the most successful candidate vaccine. It assembled into small VLPs and elicited anti‐L1 and anti‐L2 responses in mice, and antisera neutralized homologous HPV‐16 and heterologous HPV‐52 pseudovirions. The other chimaeras predominantly assembled into capsomeres and other aggregates and elicited weaker humoral immune responses, demonstrating the importance of VLP assembly for the immunogenicity of candidate vaccines.     

Highly Efficient and Economical Baculovirus Expression System for Preparing Human Papillomavirus Type16 Virus-like Particle

Human papillomavirus (HPV) is the most importantagent of human primary cervical cancer, and the list ofmalignancies caused by or associated with HPV is stillgrowing. HPV has been detected in carcinomas of larynx,esophagus, oral cavity, nasal sinus, skin, …