黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的植物表达载体构建

目的:构建除草剂抗性基因黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶的植物表达载体.方法:通过PCR从重组质粒pGWB2/Cjhppd中扩增出大小为1 300bp的目的片段,亚克隆到pGEM-T easy上.BamHⅠ和SpeⅠ双酶切pGEM-T Easy/Cjhppd和质粒pCambia1301,回收得到1 300bp的Cjhppd基因片段和开环质粒pCambia-1301-UbiN,用T4连接酶连接,得到重组质粒,利用三亲法将其导入农杆菌EHA105 中.结果:成功得到农杆菌EHA105的阳性菌落,菌落PCR扩增得到和预期大小一致的1 300bpDNA片段.结论:成功将具有除草剂抗性的Cjhppd构建到了含有玉米泛素启动子Ubi和选择性标记基因Hpt的植物表达载体pCambia-1301-UbiN/Cjhppd,并导入根癌农杆菌EHA105中,可以用于水稻等单子叶植物的遗传转化.     

开发抗病虫害的玉米

利用基因工程的方法,现在实现了在农业方面培育高产、抗病虫害和除草剂的玉米.美国Monsanto Agricultural公司和Dekalb Genetics公司在科罗拉多州Keystone召开的讨论会上报告了可育性的基因重组玉米. 在Winston J.Brill&Associates公司从事农业生物技术的W.Brill说:“这项研究是为提高玉米、小麦、燕麦、大麦、稻等谷物产量,生物技术的重要的实际应用.这次成功所用的基因操作的材料受到注目.如果使用有效的基因重组法就能很容易跟踪基因导入后的行踪.”     

玉米丛生芽体系的建立及抗除草剂转基因植株再生

以玉米优良自交系为材料, 利用芽尖分生组织诱导胚状体和丛生芽, 建立起一种快速有效且取材不受季节限制的玉米丛生芽诱导体系. 以丛生芽组织块为受体, 用基因枪将从拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体中克隆的抗除草剂基因als (acetolac-tate synthase)导入玉米细胞, 经除草剂chlorsulfuron筛选得到抗性组织块并再生植株. PCR检测和Southern杂交表明, 部分再生植株转入了als 基因. 除草剂喷施试验表明, 转基因植株及其子一代具有良好的抗除草剂特性. 建立了一种新的受基因型限制小的玉米离体培养及转基因受体系统, 能快速有效地获得大批转基因植株.     

用新基因导入法转化玉米性状

英国Zeneca公司的美国Zeneca公司(特拉华州Wilington)的研究组开发使用碳化硅结晶的基因导入法,转化玉米性状获得成功。 据Zeneca公司负责广告的Meredith McHone-Pierce说,该公司的ICI Seeds Research Center的研究组将标记基因插入玉米,培育出有完全结实能力的基因重组体。将来打算导入昆虫病原菌Ba-     

基于CRISPR/Cas9的蛹虫草无抗性标记转化技术的构建

传统的真菌遗传改造方法需要抗性标记,但目前可使用的抗性标记基因非常有限,导致蛹虫草遗传改造面临着抗性基因数量不足的问题,且尚未能实现多个目的基因的连续敲入或敲除,因此在蛹虫草中建立高效的无抗性标记转化技术显得尤为重要。本研究利用CRISPR/Cas9技术对蛹虫草的Cmura5基因进行编辑,通过内源5S-1、5S-2和U6启动子对gRNA进行转录,结果表明使用U6启动子对Cmura5基因的编辑效率达到了100%。在尿嘧啶缺陷型菌株Cmura5^-中,回补野生型Cmura5基因可实现正向选择,即野生型菌株可以在基础培养基上生长。利用设计的同源臂对Cmura5基因进行回收,可以实现反向选择,即野生型在含有5-氟乳清酸培养基中生长受到抑制。以尿嘧啶缺陷型Cmura5^-为出发菌株,利用无抗性标记转化技术,导入一个重组质粒效率为75%;连续导入2个重组质粒效率为80%;连续导入3个重组质粒效率为100%;连续导入4个重组质粒效率为50%,平均转化效率为75.7%,每一轮的标记回收率均在100%,实现了4个外源基因在蛹虫草中同时表达。     

用基因枪法将抗除草剂基因导入小麦栽培品种的研究

利用基因枪法将抗除草剂bar基因导入西南地区的 3个小麦栽培品种 ,共获得 7个转基因植株 ,转化频率在 0 .45 %～ 1 .2 %之间 ,转化周期缩短至 3个月左右。对抗性植株进行PCR和PCR_Southern杂交检测 ,初步确定bar基因已导入小麦基因组。做转基因植株叶片对除草剂PPT的抗性试验 ,有 4株呈抗性 ,3株呈部分抗性 ,表明bar基因已在小麦植株中得到表达。     

使用花粉开发植物基因重组技术

以色列Hebrew大学的J.Shilo和G.Simchen使用花粉开发了在植物中导入外来基因的方法.目前在用这种方法培育的重组型烟草的叶中表达卡那霉素耐性基因已获得成功.这种方法是把含外来基因的质粒与花粉混合使基因整合.研究者认为这种技术能应用于一般植物.与传统的植物基因重组方法不同,使用花粉避免了使导入基因的细胞再生成株的过程.这种过程需要一定技术,而且会引起植物染色体异常.使用花粉导入基因时外来基因能编入     

法院裁决Mycogen公司拥有Roundup技术

美国加利福尼亚上诉法院最近驳回了地方法院的判决,裁定Ｍｙｃｏｇｅｎ公司的子公司ＭｙｃｏｇｅｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ,Ｉｎｃ,拥有Ｍｏｎｓａｎｔｏ公司特定植物除草剂耐性和昆虫抗性技术许可证的使用选择权。该项选择权规定Ｍｙｃｏｇｅｎ公司“在有利于任何第三方许可证接受方”的条件下拥有对玉米、棉花和油用油菜Ｒｏｒｎｄｕｐ除草剂抗性技术以及用于玉米的ＢＴ抗虫基因技术的许可权。Ｍｏｎｓａｎｔｏ公司在１９８９年赠予Ｌｕｂｒｉｚｏｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ公司此项权力,而Ｍｙｃｏｇｅｎ公司在１９９２年得到了Ｌｕｂｒ…     

农作物抗除草剂基因工程

概述抗除草剂作物基因工程抗性基因的来源,产生抗性的机理,抗除草剂外源基因的导入方法,并对目前普遍关注的抗除草剂作物的安全性问题进行了讨论,提出了抗除草剂作物研究及开发中应注意的问题。     

导入昆虫抗菌肽基因的烟草的开发

农林水产省农业生物资源研究所计划调整部主任研究官大岛正弘、该研究所抗性基因研究室主任大桥祐子,东京大学药学部教授名取俊二等成功地开发出导入了昆虫抗菌肽基因的重组烟草,并用重组体确认了对2种病害细菌的抗性。期望它对减轻出于细菌感染等而发生的软腐病害方面起作用。 大岛等导入烟草的杀菌肽称为IA,是名取等从苍蝇蛹中分离克隆出来的。由39个氨基酸构成,在改变细菌细胞膜透性基础上显示杀菌效果。在美国正使用来自天蚕的抗菌肽进     

转基因植物Bt抗性管理

苏云金芽孢杆菌Bt δ-内毒素是一种潜在的抗虫(如欧洲玉米螟虫)杀虫剂。目前,已将编码这种蛋白的基因导入各种作物。但人们关心的是,这些转基因植株对昆虫的抗性会持续多久。对此,D.N.Alstad和D.A.Andow在“科学”杂志上报道,他们利用计算机模拟法设计了延长转基因Bt植物抗性的     

用基因枪法将抗除草剂基因导入小麦栽培品种的研究

利用基因枪法将抗除草剂bar基因导入西南地区的3个小麦栽培品种,共获得7个转基因植株,转化频率在0.45%～1.2%之间,转化周期缩短至3个月左右。对抗性植株进行PCR和PCR_Southern 杂交检测,初步确定bar基因已导入小麦基因组。做转基因植株叶片对除草剂PPT的抗性试验,有4株呈抗性,3株呈部分抗性,表明bar基因已在小麦植株中得到表达。     

重组玉米获准田间试验

美国BioTechnica公司由美国农业部获准基因重组玉米的田间试验.试验已在美国衣阿华州Lisbon近郊开始.玉米是被认为是难以进行基因重组的植物,该公司没有发表重组玉米的培育方法.这次进行试验的玉米是只导入标记基因的,目的是获得其在野外生长方面的数据和为今后试验有关的环境数据.研究者正在试验将高产赖氨酸的基因导入玉     

小麦抗白粉病相关基因的转化

利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因, 通过瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析, 优化了小麦幼胚愈伤组织的基因枪转化参数。小麦Beclin1类似基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST是2个在白粉菌诱导条件下具有增强表达特性的抗病相关基因。本实验进一步利用基因枪将ubi强启动子控制下的2个基因导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织细胞中, 使用除草剂经两轮选择培养基上的筛选和再生获得抗性植株, 进一步通过抗性植株的PCR分析获得转TaTBL基因植株5株, 转TaTST基因植株6株。转基因植株离体叶片的人工接种实验表明, 外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性, 表现为延缓了白粉菌的发育。利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因,通过瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析,优化了小麦幼胚愈伤组织的基因枪转化参数。小麦Beclin1类似基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST是两个在白粉菌诱导条件下具有增强表达特性的抗病相关基因。本实验进一步利用基因枪将ubi强启动子控制下的两个基因导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织细胞中,使用除草剂经两轮选择培养基上的筛选和再生获得抗性植株,进一步通过抗性植株的PCR分析获得转TaTBL基因植株5株,转TaTST基因植株6株。转基因植株离体叶片的人工接种实验表明,外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性,表现为延缓了白粉菌的发育。     

VIGS技术在昆虫基因功能研究中的应用

RNAi作为一种基因沉默的分子生物学技术,广泛应用于生物基因功能研究.在昆虫RNAi研究中,病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术是一种将dsRNA导入昆虫体内的独特策略.目前,这种方法在半翅目和鳞翅目昆虫的研究中有诸多报道.通过携带靶标昆虫基因片段的重组病毒载体侵染寄主植物,病毒在复制过程中形成dsRNA.实验昆虫取食被侵染的寄主植物后会摄入大量的dsRNA,从而达到dsRNA导入的目的.与其它dsRNA导入方法相比,VIGS技术具有高效、高通量、昆虫接受度高等优势.本文综合分析了 VIGS技术的作用机理、应用研究、影响效率的因素及其优缺点,将来应围绕这些问题进一步深化该技术在昆虫学研究中的应用.     

抗虫抗除草剂转基因玉米HiII-NGc-1的遗传稳定性分析

目的基因和目标性状遗传稳定性是转基因植物新品种选育和产业化的重要前提。以进入农业部环境释放的抗虫抗除草剂双价转基因玉米Hi II-NGc-1为试验材料,采用PCR、RT-PCR和免疫试纸条技术检测转基因玉米连续3代目的基因cry NGc和bar整合及表达的遗传稳定性,采用心叶期除草剂草铵膦抗性鉴定和心叶期/穗期亚洲玉米螟抗性鉴定实验详细分析了目标性状的遗传稳定性。研究结果表明:Cry NGc和PAT蛋白在Hi II-NGc-1中连续3代遗传稳定,高世代稳定耐受正常5倍大田除草剂草铵膦使用浓度,心叶期和穗期高抗亚洲玉米螟性状稳定,具有潜在的产业化应用价值。转基因玉米Hi II-NGc-1目的基因和目标性状遗传稳定性的明确为开展下一步生物安全评价奠定了基础,对复合性状转基因抗虫抗除草剂玉米新品种的选育和产业化具有重要意义。     

导入bar基因的水稻新植株可遗传

江苏省农业科学院粮作所王才林、赵凌、宗寿余等和中科院上海生化所龚蓁蓁等9位科研人员,用花粉管通道法将bar基因导入水稻获得可遗传的转基因植株。亦即他们利用花粉管通道法将抗Basta除草剂的bar基因导入水稻品系E32,获得转基因植株。但在T0代仅表现为部分抗性,T1代全部获得了抗性,T3代全部转基因植株能充分表达对Basta除草剂的抗性。通过对转基因植株后代进行PCR分析,证实了bar基因已整合到受体植株的基因组之中,以后又经过遗传分析表明,bar基因能在有性生殖过程中传递给后代植株,并在T3代开始就可分离出抗性一致的稳定株系。目前,其…     

β胡萝卜素基因的克隆

以色列Hebrew大学的研究组从一种分裂藻类中分离出编码八氢番茄红素不饱和化酶的基因(pds基因),并成功地克隆和定序.八氢番茄红素不饱和化酶是控制β胡萝卜素生物合成的酶.如果扩增植物中的pds基因,就有可能使β胡萝卜素(作食品添加剂)的产量提高.β胡萝卜素是维生素A的前体,可作抗氧化剂及着色剂使用.将pds基因导入后,可使果实提早着色,所以能获得上市时间长的果实. 利用pds基因,还可以开发对某些抑制八氢番茄红素不饱和化酶的除草剂有抗性的作物.实际上,目前已获得几株抗这种除草剂的变异株.     

重组病毒杀虫剂应用研究进展

应用分子生物学技术可以将昆虫特异性的毒素基因、某些酶基因等外源基因插入昆虫病毒基因组,或通过改造昆虫病毒基因组等方法构建重组病毒杀虫剂,提高杀虫效果。温室及田间释放实验证实,重组病毒杀虫剂可以显著提高现场防治效果。连续多代抗性筛选实验表明,宿主被诱导产生对重组病毒杀虫剂抗性的速度低于野生型病毒杀虫剂。采用在剂型中添加光增白剂等保护剂、在基因组中插入具有增效作用的基因、应用病毒增强蛋白等技术可以提高重组病毒杀虫效果。随着基因工程技术的发展和安全性研究的深入,以重组杆状病毒为主的重组昆虫病毒杀虫剂的应用研究正面临着突破。     

豌豆来源的毒性抗虫白蛋白cDNA在毕赤酵母中异源表达及抗虫毒性分析

一种来源于豌豆的白蛋白 (PA)对多种昆虫具有明显的毒性作用 .为了进一步研究其抗虫机理 ,采用基因工程的方法富集蛋白质 .将该白蛋白基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA .并导入毕赤酵母菌GS115中表达 .通过PCR和Northern印迹法分析基因的整合及转录 ,对工程菌进行发酵 ,采用两步培养 :第一步富集菌体 ,第二步甲醇诱导工程菌表达重组蛋白 ,并分泌到培养基中 .经过超滤和HPLC分离 ,重组抗虫白蛋白得率约 10mg L .重组蛋白对象鼻虫敏感株表现出很强的毒力 ,半致死剂量LC50 为 4 7,与直接纯化于豌豆种子的白蛋白毒力一致 ,而对象鼻虫抗性株无明显毒力 .