慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠软骨细胞表达研究

目的:慢病毒载体是一种逆转录病毒载体,可将目的基因稳定整合入宿主基因组、感染非分裂期细胞,现已成为基因工程中转移目的基因的理想载体.软骨细胞可定向成软骨,是软骨基因工程中理想的靶细胞.本文以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因作为报告基因,探讨慢病毒介导的GFP基因转染大鼠膝关节软骨细胞的最适病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)、转染效率,以及转染GFP后是否对关节软骨细胞增殖代谢活动产生影响,为下一步实验提供理论基础.方法:常规大鼠膝关节软骨细胞原代、传代培养,应用携带GFP基因的慢病毒载体转染软骨细胞.在软骨细胞培养状态最佳时,以不同MOI值(分别设定为10,20,50,100)进行慢病毒转染实验,96h后在荧光显微镜下观察GFP在软骨细胞中的表达情况,确定最佳MOI值,流式细胞术检测慢病毒转染效率,MTT法绘制生长曲线比较携带GFP基因的慢病毒对软骨细胞增殖能力的影响,以评价GFP慢病毒载体系统转染大鼠膝关节软骨细胞的高效性和稳定性.结果:置荧光显微镜下,转染96 h后,部分软骨细胞可见绿色荧光.其中当MOI=50时,慢病毒转染软骨细胞效率最高,且对软骨细胞生长状态无显著性影响,GFP阳性细胞率(转染效率)为90.1％,MTT法测生长曲线结果显示,与未转染GFP基因的对照组相比,慢病毒转染组对软骨细胞增殖活性没有显著影响(P＞0.05).结论:慢病毒介导的GFP基因转染大鼠膝关节软骨细胞的最适MOI值为50,携带GFP基因的慢病毒能高效转染大鼠膝关节软骨细胞并稳定表达,同时不影响其生物学特性,为将来应用慢病毒载体对大鼠软骨细胞进行基因改造提供了理论基础,也可作为可靠的转基因研究示踪方法,为进一步研究关节软骨疾病的治疗提供了有力依据.     

促进老年退行性骨关节炎软骨内源性修复的化合物研究进展

老年退行性骨关节炎(OA)是由关节损伤、肥胖和衰老等因素引起的一种退行性疾病,最终引起关节软骨损伤,导致运动功能障碍。软骨细胞及细胞外基质是软骨组织的主要成分,它们的损伤是引起OA的根本原因。目前OA的治疗仅限于缓解症状,而随着干细胞的发现及对软骨细胞的深入认识,开发增强软骨内源性修复的药物是OA治疗的重要方向。目前研究发现,kartogenin等化合物可以促进间充质干细胞选择性的分化为软骨细胞而起到修复作用,此外,一些化合物还可以调控软骨细胞的信号通路,起到促进软骨细胞增殖、抑制软骨细胞凋亡、抑制基质金属蛋白酶活性、增加细胞外基质合成等作用,从而维持软骨细胞的数量、促进软骨基质的合成而抑制其降解。这些方法比常规通过微创刺激内源性干细胞或移植自体细胞更加安全、有效。本文就化合物对促进老年退行性骨炎软骨内源性修复的研究进行综述,为发现更多的有效化合物提供基础。     

IL-6通过MAPK/ERK信号通路调节BMSCs软骨定向分化

白细胞介素-6(IL-6)是参与骨髓间充质干细胞(BMSCs)软骨定向分化的重要调节因子.MAPK/ERK信号通路可介导骨关节炎软骨损伤.然而,IL-6调节BMSCs定向分化为软骨细胞的分子机制尚不清楚.IL-6通过激活MAPK/ERK信号途径,抑制BMSCs的成软骨分化.本文发现,BMSCs在体外向软骨细胞分化时,Il-6基因表达水平显著下调,同时分泌到培养基中的IL-6蛋白水平亦明显降低.重组IL-6可抑制BMSCs向软骨细胞分化,软骨分化标志蛋白Runx2和Sox9的诱导表达亦相应下调.IL-6可诱导MAPK/ERK信号通路活化,加入ERK特异性阻断剂后,Runx2和Sox9的诱导表达恢复正常.结果提示,IL-6通过激活MAPK/ERK信号通路抑制BMSCs的软骨细胞分化.炎症因子IL-6对软骨细胞的再生具有不利的影响,该研究为软骨组织工程研究和骨关节炎等软骨疾病的治疗提供有价值的参考.     

骨性关节炎软骨细胞凋亡的研究

骨性关节炎是一种以软骨下骨改变和软骨退化为特征的关节退行性疾病.研究证实软骨细胞凋亡在骨性关节炎发生发展中起到关键作用.因此,研究骨关节炎软骨细胞凋亡机制及研发或筛选抗软骨细胞凋亡的药物必将给骨关节炎的防治开辟一条崭新的途径.     

骨骼畸形大鼠软骨细胞内胰岛素样生长因子-2的表达研究

目的 探讨胰岛素样生长因子-2(Insulin-like growth factor 2,IGF-2) 在骨骼畸形大鼠肢端软骨细胞内的表达规律.方法 应用光镜和透射电镜观测二(哑)英诱导的骨骼畸形大鼠足部软骨组织病理学改变.应用二(哑)英(1×10-8mol/L)干预体外培养的大鼠软骨细胞,采用RT-PCR及western 印迹杂交检测软骨细胞内的IGF-2 mRNA及蛋白质的表达水平.结果 15 μg/kg剂量的二(哑)英诱导实验组胎鼠出现多种畸形,内翻足、无尾畸形、腭裂等骨骼畸形发生率为33.3%.畸形胎鼠的肢端骨化中心发生带缩小,软骨细胞核内粗面内质网扩张,线粒体嵴紊乱.1×10-8mol/L剂量的二(哑)英使体外培养的大鼠软骨细胞内IGF-2 的mRNA及蛋白质的表达水平分别减少80%和60%(P＜0.05).结论 在二(哑)英诱导的骨骼畸形大鼠软骨细胞内IGF-2呈低表达状态.软骨细胞内IGF-2 的表达可能与骨骼发育密切相关.     

TGF—β超家族在软骨发生、发育和维持中的作用

转化生长因子β(Transforming growth factor β,TGF-β)超家族包括TGF-β和骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)两个亚家族.TGF-β超家族信号通路的配体、配体拮抗分子,受体、信号转导分子均在软骨内成骨过程中发挥各自独特的作用,参与调控软骨细胞的谱系分化、增殖、成熟、凋亡和矿化.BMP信号能起始间充质细胞向软骨细胞分化并维持软骨细胞的特性,在软骨发生过程中起主导作用;在生长板发育的过程中,BMP信号促进软骨细胞的成熟,促进成骨,而TGF-β信号抑制软骨细胞的肥大分化,维持生长板中适量的软骨细胞;TGF-β信号和BMP信号对于关节软骨的维持和修复都是不可或缺的.因此,TGF-β超家族的重要作用贯穿骨骼发育过程的始终.     

骨痹消对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

目的探讨中药早期治疗对兔实验性膝关节骨性关节炎(KOA)软骨细胞凋亡的影响。方法参照Okazaki等[1]伸膝制动OA动物模型法造模,随机分为正常组(A组)、模型组(B组)、骨痹消组(C组),于治疗6周、10周后测各组兔血清NO水平变化;软骨电镜结构及TUNEL法软骨细胞凋亡指数(AI)。结果 B组血清NO水平逐渐升高,C组有不同程度的降低;B组电镜下6周时可见凋亡细胞,10周可见凋亡小体;TUNEL法细胞凋亡原位检测:B组软骨细胞AI明显增高。治疗后C组下降明显,10周时与B组相比具极显著差异(P0.01)。结论骨痹消在一定程度上阻断软骨细胞凋亡,减少细胞凋亡数量,促进软骨的修复。     

富血小板血浆注射治疗在膝骨关节炎中的应用进展

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)由于富含多种活性生长因子，能够刺激软骨细胞增殖，促进软骨前体细胞增殖、迁移、向软骨细胞分化，促进胶原蛋白合成以及抑制软骨的炎性反应和退变，提供有利于组织修复的内环境，延缓病情进展。近年来PRP注射治疗已成为治疗与骨关节炎(osteoarthritis，OA)相关疾病的新型选择，并且疗效显著。为了进一步提高其效用，PRP注射治疗不仅在关节腔内进行，还可在软骨下骨内进行注射。软骨下骨的病变会加速软骨损耗，故有必要将软骨下骨也当作OA众多发病机制和病理过程的关键因素之一。根据PRP的生物特效以及PRP注射治疗在膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)中应用的研究进展进行了综述，同时对软骨下骨内PRP注射治疗KOA的研究进行了展望，以期为KOA的治疗提供更加有效的方法。     

SMAD3介导TGF-β1刺激软骨细胞增殖和抑制软骨细胞肥大性分化(英文)

为研究TGF β1 SMAD3信号对小鼠软骨细胞增殖和分化的影响 ,分离了野生型与Smad3基因剔除 (Smad3ex8 ex8)突变纯合子小鼠肋骨软骨细胞并进行了体外培养 .通过3 H TdR参入实验检测了体外培养软骨细胞的增殖能力 .TGF β1可以刺激野生型软骨细胞的增殖 ,Smad3基因缺失导致小鼠软骨细胞丧失对TGF β1刺激生长作用的应答 .Northern杂交显示 ,TGF β1促进野生型小鼠软骨细胞表达Ⅱ型胶原 ,而Smad3基因缺失突变纯合子软骨细胞大量表达肥大性软骨细胞的分子标记物X型胶原 .结果表明 ,SMAD3介导转化生长因子TGF β1刺激软骨细胞增殖并抑制软骨细胞的肥大性分化     

自体软骨细胞移植技术治疗膝关节软骨缺损的研究进展

膝关节软骨缺损发病率高,且自身修复能力有限。治疗膝关节软骨缺损的传统方法包括钻孔术、微骨折术、自体骨软骨移植术。然而,钻孔术和微骨折术治疗后缺损区生成的是纤维软骨,而不是正常的透明软骨,两者在力学强度、硬度、耐磨损性等多方面存在很大差距。自体骨软骨移植术可生成正常的透明软骨,但存在供体有限、不适合进行大面积软骨缺损治疗等多方面缺点在临床方面应用受限。近年来,自体软骨细胞移植技术发展迅速,越来越多的病人接受此治疗方法并获得良好效果,引起人们广泛关注。本文根据近年来国内外的各项相关研究成果进行总结,阐述膝关节软骨缺损的各种治疗方法,着重介绍自体软骨细胞移植技术。第三代自体软骨细胞移植技术生成的软骨以透明软骨为主,符合关节生物力学要求,且避免了第一代、第二代自体软骨细胞移植的术后并发症,成为治疗膝关节大面积软骨缺损安全有效的治疗方法。另外,本文就软骨细胞支架材料的发展、移植物术后的转归等问题提出进一步设想。     

负载淫羊藿苷的壳聚糖基仿生支架的促软骨形成和炎症缓解作用北大核心CSCD

淫羊藿苷(icariin, ICA)是具有促软骨修复和抗炎作用的小分子药物,将ICA负载到软骨组织工程支架将能增强支架的生物功能性。本研究将聚L-丙交酯-己内酯poly(L-lactide-co-caprolactone,PLCL)电纺纤维经聚多巴胺(polydopamine,PDA)涂覆处理后制备成的短纤维与柠檬酸/壳聚糖溶液(citric acid/chitosan solution, CC)混合,通过冻-融和冷冻干燥方法制备成短纤维增强的壳聚糖水凝胶(PDA@PLCL/CC);然后通过物理吸附方法负载ICA构建新型工程软骨仿生支架(ICA-PDA@PLCL/CC);最后通过体外兔软骨细胞培养试验,研究ICA介导的软骨仿生支架对软骨细胞功能及炎症反应的影响。结果表明,PDA@PLCL/CC具有适当的孔径和孔隙率(>80%),具有较高的吸水率和力学性能,能够促进软骨细胞增殖和黏附。ICA-PDA@PLCL/CC支架利于维持软骨细胞形态,且能促进软骨生成性基因(sox-9)、糖胺聚糖(gag)和Ⅱ型胶原(colⅡ)基因的表达和软骨基质的合成。在模拟炎症存在的情形下,ICA-PDA@PLCL/CC仿生支架可降低软骨细胞纤维化,有效下调软骨细胞促炎症因子白介素-6(il-6)、白介素-1β(il-1β)和诱导型一氧化氮合成酶(inos)的表达,减少基质金属蛋白酶-3 (mmp-3)的表达,提高软骨胞外基质糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)和Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen, ColⅡ)的合成。该研究发展的ICA-PDA@PLCL/CC工程软骨仿生支架在软骨损伤的再生修复中具有应用潜力。     

白介素1 受体拮抗剂及转化生长因子β1 对兔膝关节骨性关节炎（OA） 的治疗研究

目的:通过关节腔内注射白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)及转化生长因子β1(TGF-β1),观察其对骨性关节炎的治疗作用。方法:16只3-4个月龄新西兰大白兔(雌雄不限)随机分为四组,每组四只,分为正常组,对照组,IL-1Ra组,TGF-β1组,正常组仅打开左膝关节关节腔,剩余三组均给予左膝关节前交叉韧带离断术(anterior cruciate ligament transaction ACLT)。四周后IL-1Ra组给予关节腔内注射IL-1 Ra 5g/ml,TGF-β1组给予关节腔内注射TGF-β1 50mg/ml,每周两次,连续四周,正常组及对照组未采取任何措施。术后八周时采用空气栓塞法处死全部实验动物,取股骨远端长约1cm,固定后切片行细胞形态学观察。结果:大体肉眼观察:对照组股骨远端软骨面色颜色变暗并稍显粗糙,可见少量软骨脱落,其余两组关节软骨大体形态均接近正常。镜下观察:TGF-β1组软骨细胞增生明显,软骨细胞排列较正常软骨细胞排列轻度紊乱。IL-1Ra组软骨细胞增生数量未及TGF-β1组明显,软骨细胞排列也不及TGF-β1组规则。IL-1Ra组及TGF-β1组软骨细胞形态接近正常软骨细胞,基质染色接近正常。两组软骨膜表面光滑,无纤维细胞形成,软骨膜下未见纤维化。对照组软骨细胞数量明显减少且排列紊乱,软骨细胞形态发生改变,可见软骨细胞凋亡,镜下可见软骨细胞核浓缩、裂解,并可见新生软骨形成,突出于正常软骨膜表面,软骨膜表面下方可见血管翳及纤维母细胞形成,出现轻度纤维化。基质染色不均匀且染色较淡。结论:IL-1Ra及TGF-β1关节腔内注射均能有效抑制骨性关节炎关节软骨的退变并增加软骨细胞再生,促进软骨基质合成,延缓骨性关节炎的发病进程。     

白介素-1β诱导关节软骨细胞凋亡的分子机理

骨关节炎(OA)是一种退行性病变,表现为局限性、进行性关节软骨破坏及关节边缘骨赘形成,并伴有不同程度的滑膜炎症。软骨细胞是成熟关节软骨中唯一的细胞类型,它负责细胞外基质的合成和更新,并维持基质的完整。目前OA的发病机制尚不明确,但越来越多的研究发现致炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)起着重要的作用。IL-1β能诱导软骨细胞凋亡,其机制有一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)和丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等途径。IL-1β也是OA病变进展中破坏软骨细胞代谢平衡的主要细胞因子之一。对IL-1β诱导关节软骨细胞凋亡的分子机理的深入研究,将有助于新药的研发和骨关节病的治疗。     

羌活地黄汤含药血清对兔关节软骨细胞增值及RANKL mRNA的影响

目的:观察羌活地黄汤含药血清对软骨细胞增值及RANKL mRNA(receptor activator nuclear factor kappa B ligand)表达的影响.方法:采用血清药理学和体外培养兔关节软骨细胞的方法,通过MTS/PMS系统检测羌活地黄汤含药血清对软骨细胞增殖的影响以及采用实时荧光定量PCR检测软骨细胞RANKL mRNA表达变化.结果:羌活地黄汤含药血清对体外培养的兔关节软骨细胞有促进增殖的作用,与实验对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05),羌活地黄汤含药血清组RANKL mRNA表达量低于同一时间节点的实验时照组.结论:羌活地黄汤含药血清能促进体外培养的软骨细胞增殖,同时能抑制软骨细胞RANKLmRNA的表达.     

TGF-β超家族在软骨发生、发育和维持中的作用

转化生长因子b(Transforming growth factor b, TGF-b)超家族包括TGF-b和骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)两个亚家族。TGF-b超家族信号通路的配体、配体拮抗分子、受体、信号转导分子均在软骨内成骨过程中发挥各自独特的作用, 参与调控软骨细胞的谱系分化、增殖、成熟、凋亡和矿化。BMP信号能起始间充质细胞向软骨细胞分化并维持软骨细胞的特性, 在软骨发生过程中起主导作用; 在生长板发育的过程中, BMP信号促进软骨细胞的成熟, 促进成骨, 而TGF-b信号抑制软骨细胞的肥大分化, 维持生长板中适量的软骨细胞; TGF-b信号和BMP信号对于关节软骨的维持和修复都是不可或缺的。因此, TGF-b超家族的重要作用贯穿骨骼发育过程的始终。     

前交叉韧带损伤后软骨退变和骨性关节炎发生的分子变化

为了探讨凋亡酶的半胱天冬酶3 (Caspase 3)、促炎细胞因子interleukin-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和基质金属蛋白酶降解酶-13 (MMP-13)的表达水平,来说明前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)损伤后软骨细胞的软骨变性和骨性关节炎的发展情况,本研究通过探讨软骨降解程度与损伤时间或患者年龄之间的关系,应用实时聚合酶链反应检测正常人(n=5)和ACL破裂患者(n=42)软骨细胞中IL-1β、IL-6和MMP-13 mRNA的表达水平,采用Western blotting检测MMP-13和Caspase 3蛋白表达水平。通过趋势分析和相关系数分析,分别得出MMP-13、IL-6、IL-1β基因表达与软骨缺损分级,MMP-13、IL-6、IL-1β基因表达与患者年龄的关系。结果表明,软骨降解程度与损伤时间之间存在相关性。与正常相比,ACL损伤的软骨细胞中,MMP-13、IL-6、IL-1β和Caspase 3的表达水平有显著上调。在ACL缺陷患者中,与ACL缺陷未到18个月的患者相比,在超过18个月的患者中发现MMP-13明显上调,而超过10月的患者软骨细胞中IL-6和IL-1β表达水平要高于未到10个月的ACL缺陷患者。同时,IL-1β、IL-6和MMP-13表达水平和软骨损伤或病人的年龄之间没有关联。研究发现,软骨细胞凋亡、炎症和分解代谢因子水平的升高与损伤时间有关,并可能导致ACL损伤后软骨退变和骨性关节炎的发生。     

透明质酸在间充质干细胞向软骨细胞分化中的应用

随着组织工程学的发展,利用间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)定向分化为软骨细胞,用于治疗骨性关节炎、关节创伤等因素造成的软骨缺损的研究方兴未艾。透明质酸(hyaluronic acid,HA) 是一种酸性多糖类生物大分子,亦是软骨基质的主要成分之一。由于其优良的生物相容性、可降解等特性,HA已成为优良的天然生物材料,其作为支架材料应用于软骨缺损修复已有一段历史。近年来又发现,HA除作为载体支架材料外,还可作为调节因子应用于MSCs向软骨细胞分化。以下将对近年来利用HA应用于MSCs向软骨细胞分化的研究进行总结,旨在为以MSCs为基础的组织工程化软骨的临床应用奠定基础。     

FGF9与FGFR3受体在骨发育与疾病中的作用

成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor,FGF9)最初发现于人类神经胶质瘤细胞,是成纤维细胞生长因子家族的成员之一.研究发现FGF9在多种组织的发育及疾病的发生中起重要作用.FGF9与肝素结合活化FGFR3受体,可作用于软骨细胞,在骨骼发育及损伤过程中抑制软骨细胞增生和软骨内骨化.FGF9基因缺失或突变可分别导致骨骼发育不良或肿瘤.本文简要综述FGF9与FGFR3受体在骨发育中的作用及其致病机制的研究进展.     

兔膝关节损伤后软骨细胞中OPG与RANKL表达

目的:随着中国经济的高速发展,人民生活水平日益增高。体育运动,高能量机动车造成的膝关节损伤数量不断增加,关节软骨的损伤恢复一直不是很理想。针对其后期的恢复研究做了许多相关的实验。本实验通过对兔膝关节软骨细胞损伤后软骨细胞中OPG(骨保护素)与RANKL(核激活因子受体配体)两种因子在损伤后与正常软骨细胞中的表达的比较,探讨损伤后软骨细胞中OPG和RANKL的表达。方法:25只大耳白兔随机分成5组,每组5只。前4组在10天完成20只兔左后腿膝关节软骨损伤动物模型,最后1组5只做手术对照组,术后处置相同。在术后1周,2周,4周,8周时取膝关节软骨损伤处关节软骨制成标本对照组取正常膝关节软骨制成标本。应用HE染色观察软骨细胞恢复情况及SP免疫组化法检测软骨细胞中OPG与RANKL的表达。在光镜下观察,通过医学图像分析软件(media cybernetics image-proplus6.0)图片分析,测定镜下相对灰度值并计算每个标本的平均灰度值,单因素方差分析法进行数据分析。结果:OPG在膝关节损伤后2-4周表达最高,4-8周有下降趋势。RANKL在膝关节软骨损伤后明显表达并逐步的呈升高趋势。实验组镜下观察表达较强烈,测定镜下平均灰度值与对照组有显著性差异(P0.05)。结论:1.OPG在膝关节软骨损伤后显著性表达。2-4周表达较高,4-8周趋于降低。2.RANKL在膝关节软骨损伤后显著表达,1-8周呈平稳上升趋势。     

甲状旁腺素促进小鼠软骨细胞成软骨和抑制其终末期分化的实验研究

目的探讨甲状旁腺素(PTH)对小鼠软骨细胞成软骨性的促进作用和终末期分化的抑制作用。方法分离和培养新生小鼠胸骨软骨细胞,经PTH处理,倒置显微镜观察细胞形态的变化;Alcian蓝染色和碱性磷酸酶(ALP)染色方法检测软骨细胞蛋白多糖和ALP的分泌;RT-PCT法和Western blot方法检测细胞内成软骨因子和病理性肥大分化因子基因和蛋白的表达。结果新生小鼠胸骨软骨细胞具有自发成熟分化的特征,与对照组相比,经PTH处理的细胞更接近于软骨细胞形态;PTH明显提高软骨细胞Alcian蓝染色的强度,降低ALP染色的强度;PTH显著提高细胞内Sox9和Aggrecan基因和蛋白的表达,明显降低ALP和Runx2基因和蛋白的表达。结论 PTH具有促进小鼠软骨细胞成软骨和抑制其终末期分化的作用。