琼脂糖凝胶直接杂交法

DNA印迹(Southern blot)杂交法是研究DNA分子结构,变异及其组成的一种分子生物学技术。自1975年闻世以来,在分子生物学,遗传学及分子病毒学等研究领域得到广泛应用,对这些学科的发展起了重要作用。由于该技术均需要首先将电泳后已变性的DNA从琼脂糖凝胶转移至支持膜上,因此,实验结果的好坏很大程度取决于吸印的效果,同时也受支持物     

一种改良型的免疫印迹法

目的:蛋白免疫印迹法是现代生物实验过程中运用最为广泛的实验技术,常规的免疫印迹法在应用过程中存在很多弊端,如浪费抗体等,因此非常有必要探索出一种新型的免疫印迹法,本文旨在探索一种能够节约抗体的免疫印迹实验方法。方法:将8只SD大鼠随机分常规组和改进组两组,每组4只,活取视网膜组织,进行组织匀浆、蛋白定量,取不同蛋白总量的匀浆变性液进行β-Tubulin的免疫印迹实验,比较两组之间β-Tubulin的蛋白表达量之间是否存在显著性差异,实验需重复三次。结果:不同总量蛋白的免疫印迹显示两组之间β-Tubulin的表达量并无显著性差异。但是,相比常规方法,改进法使用的抗体量更少,条带更容易检测得到。结论:改进后的免疫印迹法能有效的节约抗体,操作方便,实用性强。     

地高辛标记的Northern blot检测鼠疫菌sRNA

[目的]随着高通量测序方法的应用,越来越多的sRNA (small non-coding RNA,sRNA)需验证.本研究建立用地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA的技术,为细菌sRNA验证提供一种灵敏、特异的方法.[方法]在低铁条件下,提取鼠疫菌总RNA,10％ dPAGE分离后电转到尼龙膜上并用紫外线交联RNA.膜经地高辛标记RyhB1或RyhB2寡核苷酸RNA探针过夜杂交后洗脱、封闭和免疫检测,最后曝光显影.[结果]地高辛标记的Northern blot曝光时间为20 s-3 min,RyhB1或RyhB2检测灵敏度分别为0.005 μg和0.05 μg.RyhB1或RyhB2探针特异性好,相互间无交叉反应.带正电或中性的尼龙膜都适用于杂交反应.RNA探针在42℃-65℃内杂交均可,提高温度可减少非特异性反应;而DNA探针杂交温度需摸索.[结论]本研究成功构建一种地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA技术,具有特异性好、灵敏度高、探针易保存、曝光时间短等优点,为细菌sRNA验证和功能研究提供有利工具.     

一种基于链霉素沉淀的PrPSc检测方法的建立

建立一种新的基于链霉素沉淀的PrPSc的Western blot检测方法,用终浓度为60 mmol/L的链霉素处理蛋白酶K消化的PrPSc贮存液,通过离心沉淀PrPSc,用Western blot对PrPSc的链霉素富集效果进行检测.结果显示,链霉索能够与PrPSc结合形成高分子量复合物,但不影响糖基化形式.此外,基于链霉素沉淀的Western blot,无论是在低浓度或是大容积的条件下,均可显著地提高对PrPSc检测的敏感性.基于链霉素沉淀的Western blot试验是一种敏感、特异、快速及灵活的检测方法,有潜力用于脑组织、外周组织及体液中低水平的PrPSc的检测.     

SARS冠状病毒结构蛋白在血清学诊断中潜在应用价值的比较

为了确定特异的SARS抗体检测抗原,比较了SARS冠状病毒(SARS-CoV)主要结构蛋白与SARS患者血清的反应性。从SARS死亡患者的肺组织提取的总RNA为模板,用RT-PCR技术分别扩增S、N、M和E4种结构蛋白基因,对3种S截短突变体和N、M、E的重组蛋白在大肠杆菌中进行表达。以表达的蛋白为抗原,应用Western blot跟踪检测11例SARS患者血清54份。结果显示：SARS—CoV的重组N蛋白和s蛋白有很强的抗原性,s蛋白的3个区段的抗原性强弱存在差异,S3抗原性强于S1和s2;在患病第1周、2周、3周及3周以上,N蛋白和s3蛋白抗体检出率分别为40％、65。2％、100％、100％和40％、61％、76.2％、100％;提示SARS-CoV重组N蛋白和S3蛋白在SARS的血清学诊断中有一定的应用价值。     

HSVⅠ感染L-02细胞对核不均一性核糖核蛋白H2（hnRNP H2）表达影响

单纯疱疹病毒（HSVⅠ）对宿主细胞转录及mRNA修饰翻译通路的调控是一个系统的、复杂的体系,探索其具体机制将有助于了解病毒复制过程及与宿主细胞之间的相互作用。基于2-DE分析,人胎肝细胞 L-02细胞核不均一性核糖核蛋白H2（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2,hnRNP H2）在感染HSVⅠ前后存在表达差异,通过Western blot ,Northern blot等技术方法验证其在病毒复制过程中不同时段对其表达影响。     

液相杂交快速检测特异DNA

检测特异DNA片段的方法中,传统Southern blot技术由于其高度可重复性及能够显示条带大小的特性,一直是DNA检测的“黄金标准”.但是杂交时间长,步骤复杂,放射性污染等问题亟待解决.为了简化Southern blot,研究使用了一种液相杂交快速检测DNA的方法,即使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的dUTP掺入探针后,在溶液中与待检测DNA样本42℃下杂交,然后琼脂糖凝胶电泳检测荧光杂交信号.利用质粒为模板,优化了探针制作、杂交液组成、杂交时间和温度等参数.在FITC-dUTP∶ dTTP比例为1∶3、模板质粒浓度为50μg、1×杂交缓冲液(25 mmol/LTris,10mmol/L EDTA,8mmol/L Nacl,PH =8.0)中95℃变性5～9 min和42℃杂交3h的实验条件下,可检出1.2μg的质粒,探针灵敏度为7.3 ng/μl.这种方法不需要转膜,曝光,大大节约了时间,简化了操作,荧光检测也为该方法同时检测多色样本提供了可能,可广泛应用于核酸检测.     

基于DIG -化学发光法的Southern blot方法优化

目前,基于DIG-化学发光法的Southern blot技术已在生物实验室广泛应用,但在试验过程中经常会遇到背景黑、目的信号弱等问题,以致不能获得理想结果.在棉花线拉体基因组RFLP分析过程中结合前人经验对基于DIG -化学发光法的Southern blot技术在探针标记、探针浓度、探针剥高等方面进行了优化.优化后的方...     

番茄SlMYB86基因的原核表达及缺氮胁迫下的表达分析北大核心CSCD

MYB转录因子参与植物细胞形态与模式建成、次级代谢的调控以及生物和非生物胁迫应答等反应。该研究采用RT-PCR方法扩增了番茄SlMYB86基因,并进行了聚类分析和保守域序列分析,构建原核表达载体和诱导纯化蛋白,利用qRT-PCR和Western blot检测SlMYB86在缺氮复氮下的表达水平,为深入探究番茄MYB86转录因子在缺氮胁迫下的功能奠定基础。结果表明:(1)番茄SlMYB86与番茄SlMYB26在进化树上属于同一分支,亲缘关系较近,且SlMYB86含有2个Myb_DNA-binding保守结构域,属于R2R3-MYB型转录因子。(2)qRT-PCR分析发现,SlMYB86基因在番茄根和叶中均有表达,缺氮胁迫下SlMYB86表达较对照显著增加。(3)成功构建pET-28a-SlMYB86原核表达载体并转化E.coli BL21(DE3),SDS-PAGE和Western blot结果表明,SlMYB86蛋白的最佳诱导条件为0.5 mmol/L的IPTG、37℃诱导8 h;目的蛋白相对分子量大约为41 kD,与预期大小一致,并获得较高纯度的SlMYB86原核蛋白。(4)将纯化的SlMYB86蛋白免疫小白鼠获得抗体,利用该抗体进行Western blot分析发现,番茄中SlMYB86蛋白在缺氮胁迫后表达上调,表明番茄SlMYB86基因参与了缺氮胁迫的应答。     

兰州百合精细胞特异蛋白的研究

通过低渗冲击及Percoll密度梯度离心的方法,成功地分离并纯化了兰州百合(Lilium davidiiDuch.)生活的生殖细胞及精细胞。从精细胞、生殖细胞及叶片中提取了全蛋白,并通过双向电泳技术对它们进行了比较。在双向电泳图谱上精细胞比生殖细胞显示更多的蛋白斑点,特别是在碱性端。通过混合酶解及离心,分离了生活的叶肉原生质体。用生物素的琥珀酰胺酯衍生物(NHS-biotin)对精细胞、生殖细胞及完整的叶肉原生质体质膜蛋白进行标记,然后进行Western blot分析,用辣根过氧化物酶酶标链霉抗生物素蛋白及其底物4-氯-1-萘酚反应显色,比较了3种质膜蛋白。发现分子量为46kD及50kD的两种蛋白是精细胞质膜特异的。在双向电泳图谱上也可找到与这两种蛋白相对应的斑点,它们很可能与受精过程中精卵的识别有关。     

细胞印迹法

<正> 免疫印迹法即利用免疫学检测混合物中蛋白有效成分的一种技术:经凝胶电泳分离后的蛋白有选择地印迹到NC纸上。该技术已被广泛地应用于现代生物学研究中。相反,细胞印迹法即检测特异蛋白质束缚于专一细胞上的一种方法:经电泳分离后印迹到NC纸上。该法仅在必要时才应用。本文就两种细胞印迹技术及有关操作方法作了介绍,并就这些技术的可能意义进行了讨论。     

斜纹夜蛾嗅觉受体基因Ⅱ的表达谱分析

气味调控斜纹夜蛾Spodoptera litura的觅食、 交配和产卵等行为, 而嗅觉受体（olfactory receptor, OR）作为气味的直接受体, 是嗅觉神经信号产生的起点, 是嗅觉信息的编码及信号的传递通路的重要组成部分。本研究通过RT-PCR和Western blot技术, 对斜纹夜蛾嗅觉受体基因Ⅱ（Spodoptera litura olfactory receptor gene Ⅱ, SlitOR2）（GenBank登录号： DQ845292）的组织特异性和不同发育阶段表达情况进行分析鉴定。半定量RT-PCR研究结果表明, SlitOR2主要在成虫期的触角中表达, 其他部位和发育期未检测到表达。Western blot鉴定结果表明SlitOR2主要在成虫触角表达, 与半定量RT-PCR结果基本一致。但在成虫足、 头和中期蛹中也看到有微量蛋白表达。可能是与目的蛋白大小类似的其他非特异性蛋白条带, 也可能是该蛋白在成虫足部、 头部和中期蛹中有微量表达, 因为足部的跗节和头部的口喙也分布有少量的嗅觉感器。目的条带单一清晰, 表明制备的多肽抗体特异性较好, 可以用于后续相关实验。     

家蚕生殖细胞相关基因nanos的克隆表达及在胚胎发育中的表达模式

【目的】探讨nanos基因在家蚕Bombyx mori胚胎发育中的表达模式,为进一步研究该基因在家蚕胚胎发育中的功能奠定基础。【方法】根据本实验室提交到GenBank中家蚕nanos的cDNA序列(登录号EF647589)设计引物,扩增出了一条长684 bp的编码片段,对该片段进行了克隆和表达,亲和纯化表达的蛋白并免疫新西兰大白兔制备抗体。Western blot检测家蚕早期胚胎nanos的表达情况,荧光定量PCR检测nanos在整个家蚕胚胎发育中的表达情况。【结果】克隆并表达了一条长684 bp的编码片段,得到了分子量约33 kD的融合蛋白。用制备的抗血清对家蚕早期胚胎蛋白的Western blot检测表明,nanos在此阶段基本是恒定表达。荧光定量PCR结果显示刚产的卵中nanos的表达量最大,第2天开始急剧下降,此后到第10天表达量几乎没有变化。【结论】本实验克隆的nanos是家蚕中的一个同源物,该基因在家蚕胚胎发育中的表达模式与蜜蜂等有很大的不同,反映了昆虫生殖细胞形成机制的多样性。     

乙型肝炎病毒持续感染患者细胞内病毒复制的研究

用Southern blot技术对乙肝病毒感染肝脏和外周血白细胞的情况进行了对比研究,发现白细胞的阳性率为44％,肝组织的阳性率为46％,两者无统计学差异。根据琼脂糖凝胶电泳速度可将病毒DNA分子分为游离型、整合型和混合型,配对检查两者亦无明确相关性,说明外周血白细胞是乙肝病毒攻击的靶细胞,亦是病毒复制的场所。白细胞中病毒DNA游离型与血清学指标HBeAg( ),HBV DNA斑点杂交( )关系密切,而整合型除与上述指标有关外,还和抗-HBe( )有关,表明病毒在乙肝发病过程中复制和部分静止的差异。     

用重组Epstein-Barr病毒早期蛋白P83为抗原检测鼻咽癌病人血清中IgA抗体

以重组EB病毒早期蛋白P83为抗原,用Western blot检测了135份鼻咽癌病人和100份正常人血清中IgA/P83抗体,阳性率分别为96％和0,以常规的间接免疫酶法检测这两种血清中IgA/EA抗体,阳性率分别为71％和0。IgA/P83抗体的几何平均滴度较IgA/EA高4倍以上。这表明,用Western blot查IgA/P83敏感、特异,可替代用间接免疫酶法查IgA/EA用于鼻咽癌的早期诊断。     

HSV I感染L-02细胞对核不均-性核糖核蛋白H2（hnRNP H2）表达影响

单纯疱疹病毒（HSV I）对宿主细胞转录及mRNA修饰翻译通路的调控是一个系统的、复杂的体系,探索其具体机制将有助于了解病毒复制过程及与宿主细胞之间的相互作用。基于2-DE分析,人正常肝细胞L-02细胞核不均一性核糖核蛋白H2（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2,hnRNPI-12）在感染HSVI前后存在表达差异,通过Western blot,Northern blot等技术方法验证其在病毒复制过程中不同时段对其表达影响。     

甘蓝型油菜小核糖核蛋白BnSmD1编码区全长cDNA 的克隆与表达分析

通过筛选野生型油菜(Pet33-10)与无花瓣油菜(Apet33-10)反向消减文库(SSH)和运用RACE-PCR技术, 获得了甘蓝型油菜小核糖核蛋白BnSmD1的全长编码区 cDNA (GenBank登陆号DQ298446)。该基因长484 bp, 含有一个长354 bp的阅读框。BnSmD1在N端拥有两个高度保守的结构域(Sm-1和Sm-2), 羧基端则含有一个RG重复序列。Northern blot表达结果显示: BnSmD1在甘蓝型油菜的各个组织均有表达, 但是它在早期花蕾中的表达明显高于同期的叶和茎。通过对BnSmD1在Apet33-10无花瓣品系与野生型有花瓣品系Pet33-10中各组织的表达差异进行比较, 发现该基因在Apet33-10的早期花蕾中表达明显下降。因此, BnSmD1可能对植物的早期花发育起到了重要的作用, 并很有可能影响花瓣的形成。     

半夏凝集素基因(pta)导入水稻及其表达的初步研究

半夏凝集素基因是一种有重要价值的抗虫基因。利用RACE—PCR技术克隆出半夏凝集素(pta)基因,并将它构建到载体pCAMBIA1305中形成双元载体(含pta基因和hpt基因)。利用农杆菌介导法将pta基因转入粳稻品种鄂宜105、中花12和籼稻品种E优532成熟胚诱导的愈伤组织中。通过PCR检测,从117株To代再生植株中筛选出36株(其中鄂宜105、中花12、E优532分别为19株、7株、10株)转基因植株。对这些转基因后代植株进行Southern blot分析和RT—PCR分析表明：pta基因已经整合到受体细胞基因组中,并在转录水平上得到了有效表达。通过对转基因后代的遗传分析,成功地从T1代表现为1：2：1盂德尔分离的分离群体中筛选出7个独立转基因水稻纯系(其中包括4个鄂宜105、1个中花12和2个E优532转基因纯系)。对这7个独立转基因水稻E代纯系进行褐飞虱生物抗性鉴定和田间隔离喂养实验,结果显示,这些转基因纯系对褐飞虱的存活率和发育进度均有显著的抑制作用。同时,实验结果还表明2～5mg/L的2,4—D是愈伤组织诱导和生长的必需条件,而且受体的基因型对愈伤组织诱导率和转化频率均有显著影响,在同等条件下,粳稻品种的愈伤组织诱导率和转化频率均高于籼稻种。     

近10年高考生物学实验题的特点与生物学实验课教学

随着高考内容改革和素质教育的深入 ,对考生的能力和素质也提出了更高要求。近 1 0年来 ,高考生物学试题中侧重实验的题量增大 ,突出了生物学是实验科学这一特征。当前生物学教材改革和高考要求 ,为改进和加强生物学实验课教学提供了思考的内容。1 999年开始恢复生物学高考 ,按照教育部教学 [1 999]3号文件精神 ,新一轮高考改革的难点和重点是高考内容改革 ,内容改革的任务之一就是在总体上更加注重对考生能力和素质的考查。生物科高考《考试说明》( 1 999年 )提出了对考生的 6项能力要求 ,其中之一就是能使用恰当的方法验证简单的生物学事…     

脂肪酶生物印迹研究进展

脂肪酶是一种广泛应用的水解酶。生物印迹技术是一项新兴技术,它使脂肪酶在有机溶剂中发挥更好的催化能力,如更高的活性和稳定性,从而扩大了脂肪酶作为生物催化剂在工业上的应用。本文介绍了脂肪酶蛋白质的结构特点,脂肪酶生物印迹的过程和原理,对生物印迹过程中印迹模板的种类和选择原则、保护剂的作用等主要影响因素进行了讨论,并对不同种类脂肪酶的生物印迹条件和适用的反应及生物印迹效果作了归纳总结,指出了目前脂肪酶生物印迹技术存在的问题和发展前景。