马传贫病毒主要基因变异研究进展

马传贫病毒是反转录病毒科慢病毒属的成员之一,它在体内要通过反转录酶的作用合成DNA,整合到宿主的基因组中进行复制,由于反转录酶没有校正功能,使病毒在体内复制过程中错误拷贝RNA基因组,导致高频率的遗传变异。近年国内外学者对EIAV的研究发现变异的基因主要集中在env、gag、LTR和S2等区域,这些区域基因的变异与病毒的毒力、病毒在体内的复制水平及免疫原性密切相关。由于EIAV是慢病毒中最简单的病毒,它具有独特的发病进程和明显的病程分界,使其成为研究包括HIV内其它慢病毒基因变异与临床症状之间相互关系的理想动物模型。因此对EIAV基因变异情况的研究具有重要意义。     

马传染性贫血强/弱毒嵌合病毒的体外构建

马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)引起马传染性贫血(简称马传贫),导致马持续性感染和反复病毒血症[1].EIAV与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属,二者有很多相似的特性[2].在反转录病毒前病毒基因组两端含有长末端重复序列(long terminal repeat,LTR).LTR含有真核启动子,其中含有病毒转录调控顺式作用位点,病毒编码的反式作用因子与其结合后可以反式激活基因的表达,对病毒基因的表达和其它生命活动起重要调控作用[3,4].因此,LTR序列的变异可能会引起病毒转录和复制方式的改变,进而引起其细胞嗜性和致病性的改变[5,6].为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,用EIAV强毒L株LTR置换了以前构建的EIAV DLA(弱毒)感染性分子克隆中的LTR,构建了马传贫强/弱毒嵌合分子克隆,并获得了具有感染性的强/弱毒嵌合病毒.     

几种药物抑制马传染性贫血病毒和人免疫缺陷病毒的实验研究

用马传染性贫血病毒—驴胚肺二倍体细胞(EIAV-DELDC)为实验体系,以细胞中病毒逆转录酶活性及病毒相关抗原的表达为观察指标,检测了叠氮胸苷(AZT)、三氮唑核苷(Ribavirin,病毒唑)、磷羧基甲酸钠(PFA)和苏拉明等4种已知抗人免疫缺陷病毒(HIV-1)药物对马传染性贫血病毒的抑制作用。结果表明,PFA、AZTTP(三磷酸AZT)和苏拉明均能抑制病毒相关抗原的表达,AZT虽无此作用,但能抑制细胞内逆转录酶活性。用~3H-TMP掺入法比较了PFA、AZTTP、苏拉明对体外无细胞系EIAV逆转录酶粗提物和HIV-1基因工程产物逆转录酶活性的抑制作用表明,两种逆转录酶对苏拉明的敏感性相近,而HIV-1逆转录酶对PFA和AZTTP的敏感性较EIAV者高约100倍。又以无细胞系中逆转录酶活性测定法,检测了12种中药提取物的抑制作用,其中小柴胡汤对EIAV和HIV-1逆转录酶活性都有抑制作用,IC_(50)为717μg/ml和700μg/ml(生药浓度)。小柴胡汤对两种病毒感染细胞中抗原的表达和HIV引起细胞病变都有抑制作用,对HIV-1的抑制比EIAV强。这些结果表明,EIAV-DELDC体系可考虑作为抗HIV-1药物筛选模型。     

反转录病毒基因转移载体

80年代初期,以反转录病毒作载体进行基因转移的技术迅速发展起来。以反转录病毒作载体进行基因转移具有以下几个方面的特点:宿主细胞范围广;病毒感染滴度高;病毒感染宿主细胞后,细胞不发生病变,可以稳定地表达外源基因;基因转移效率高,病毒基因往往以低拷贝整合,易于外源基因表达的研究;反转录病毒较小,易于操作,容纳的外源基因较大(10kb左右);基因转移后不发生重排;经特殊构建的反转录病毒载体,不易产生感染性病毒粒子,比较安全。为了构建一个基因转移效率高、宿主范围广、安全的反转录病毒基因转     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱及免疫保护机制研究进展

马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus, EIAV)弱毒疫苗是中国科学家在20世纪70年代研制成功的世界上首例慢病毒疫苗,是迄今为止唯一在临床大规模应用的慢病毒弱毒疫苗。EIAV弱毒疫苗的成功应用不仅消除了该疫病对马业的威胁,而且在学术上突破了慢病毒不能免疫的理论。该疫苗克服了灭活疫苗免疫原性差的难点,能有效地提供对同源和异源毒株的免疫保护。因此,在分子水平上阐明EIAV弱毒疫苗的减毒机理和免疫保护机制对于研究慢病毒免疫保护具有极其重要的科学意义。作者所在的研究团队多年来一直从事EIAV弱毒疫苗的致弱机理及其诱导免疫保护机制的研究,解析了EIAV弱毒疫苗及其强毒株的基因组进化特征、揭示了疫苗致弱规律和疫苗有效组成、提出了"EIAV弱毒疫苗可能起源于EIAV准种的一个小分支"的假说;发现EIAV弱毒疫苗可有效激活天然免疫和特异性免疫,早期诱导的高水平细胞免疫与免疫保护呈正相关;证明了疫苗株的抗原多样性组成是其诱导保护性免疫应答的关键因素。相关研究成果拓展了慢病毒疫苗研究理论和实践认知,可为其他慢病毒尤其是HIV-1免疫原的设计以及免疫保护理论提供有价值的参考。     

EIAV与HIV分子生物学相关性研究进展

马传染性贫血病毒 (equineinfectiousanemiavirus,EIAV)与人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus ,HIV)同属逆转录病毒科、慢病毒属成员。两者在形态结构、抗原特性、基因组构成以及病毒与宿主的持续作用等方面极为相似 ,且EIAV具有独特的快速发病进程和明显的病程分界 ,使其成为研究HIV的基因变异与临床症状之间相互关系的理想动物模型。EIAV疫苗是我国拥有自立知识产权的世界上唯一的慢病毒疫苗 ,以该疫苗为基础 ,开发新型HIV疫苗将成为今后的发展策略。近年国内外学者对EIAV及HIV的分子生物学进行了深入研究 ,确定了与病毒毒力相关的某些基因及编码蛋白 ,并在疫苗的研究上取得了一定进展。     

科研快讯

正Nature:最新研究或帮助改善HIV疗法的开发刊登于国际杂志Nature上的一项最新研究中,来自明尼苏达大学等机构的科学家们开发了一种抵御HIV/AIDS及以反转录病毒为基础的癌症的新型治疗方法,文章中,研究者采用了一种利用固化分子X射线技术的实验性步骤进行研究,他们揭示了一种名为呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的促癌反转录病毒如何集合多种蛋白(整合酶)拷贝从而形成小型分子,这种小型分子就会将RSV的遗传物质插入到宿主细胞中,最后制造大量的反转录病毒。     

利用流式细胞术测定CTL活性方法在EIAV免疫学中的应用

利用PKH 26和CFSE两种荧光染料对靶细胞染色,建立了一种通过流式细胞术进行马传染性贫血症病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)反应的新方法,避免了经典的Cr51释放法对检测人员的放射线威胁,降低了本底释放,提高了检测的灵敏度.将该检测方法用于检测EIAV疫苗毒接种马和嵌合克隆接种马的细胞免疫反应变化趋势,数据显示细胞免疫反应在接种后3个月达到成熟阶段而后保持在较高的反应水平.该方法的成功建立和应用为研究EIAV减毒疫苗的免疫机制提供了好的研究手段,也为其他病毒的免疫学研究提供了新的参考方法.     

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株及其亲本驴强毒株长末端重复序列(LTR)的启动子活性比较

将马传染性贫血病毒驴强毒(donkey-adapted equine infectious anemia virus,D-A EIAV)、马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒(donkey leukocyte attenuated EIAV,DLA EIAV)及EIAV Wyoming株的全长长末端重复序列(LTR)分别克隆到报告基因载体pCAT-Basic vector中,获得重组质粒p-D-A-LTR-CAT、p-DLA-LTR-CAT及p-Wyo-LTR-CAT.将这3个重组质粒分别体外转染EIAV阴性健康驴的白细胞,比较这三者LTR启动报告基因CAT表达的基础活性和在tat-pcDNA3共转染条件下激活活性的差异.结果表明:在驴白细胞中,DLA EIAV LTR启动CAT表达的活性略高于D-A EIAV LTR;而与EIAV Wyoming株LTR比较,DLA EIAV与D-A EIAV二者LTR启动CAT表达的活性都较低.在有共转染重组表达质粒tat-pcDNA3条件下,D-A EIAV、DLA EIAV及EIAV Wyoming株LTR起始CAT表达的活性都得到提高,分别提高了4.8倍、6.0倍和3.2倍.上述结果提示,LTR可能是体现DLA EIAV驴白细胞适应性的因素,不一定是影响其毒力减弱的根本原因.     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株与亲本强毒株的体内病毒载量与诱导保护性免疫关系的研究

慢病毒免疫应答的载量阈值学说认为病毒载量决定了机体对病毒反应的类型。为了探讨马传染性贫血病毒(EIAV)血浆病毒载量与马体免疫保护的相关性,本研究利用Real-time RT-PCR方法对EIAV弱毒疫苗株(EIA-VDLV125)免疫马和EIAV强毒株(EIAVLN40)非致死剂量接种马血浆中病毒载量进行了动态比较。结果显示两组马在监测过程中皆可检测到相似水平的病毒载量(103～105copies/mL),且两者之间差异不显著(P0.05)。以上毒株接种23周后,对马匹进行了强毒株(EIAVLN40)的致死剂量攻毒,根据攻毒后典型马传贫急性发病与否确定接种保护率。结果显示,疫苗组的保护率为67%而非致死剂量强毒组的保护率为0。以上结果提示,病毒血浆载量不是决定EIAV弱毒疫苗诱导免疫保护能力的主要或单一因素。     

反转录病毒感染与肿瘤发生

病毒感染与癌症的关系是生物医学领域中非常重要的研究方向, 估计当前全世界至少20% 人类肿瘤的发生与病毒感染有密切联系。本文对反转录病毒诱发肿瘤的各种作用机制进行了详细阐述。根据致病速度的快慢, 反转录病毒被分为两大类: 能迅速诱导肿瘤产生的急性转化反转录病毒和缓慢诱导肿瘤产生的非急性转化反转录病毒。急性转化反转录病毒通过其自身携带的癌基因快速诱导肿瘤产生, 而细胞原癌基因的插入激活则是非急性转化反转录病毒引起肿瘤的主要机制。对反转录病毒致瘤机制的研究揭示了肿瘤发生过程中的一些重要原理和机制, 包括原癌基因激活以及肿瘤抑制基因失活等, 对探讨非病毒引起的人类肿瘤的发生机制同样具有重要的参考意义。     

利用流式细胞术测定CTL活性方法在EIAV免疫学中的应用

利用PKH-26和CFSE两种荧光染料对靶细胞染色,建立了一种通过流式细胞术进行马传染性贫血症病毒 (Equine infectious anemia virus,EIAV)抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)反应的 新方法,避免了经典的Cr51释放法对检测人员的放射线威胁,降低了本底释放,提高了检测的灵敏度。将该检测方 法用于检测EIAV疫苗毒接种马和嵌合克隆接种马的细胞免疫反应变化趋势,数据显示细胞免疫反应在接种后3 个月达到成熟阶段而后保持在较高的反应水平。该方法的成功建立和应用为研究EIAV减毒疫苗的免疫机制提 供了好的研究手段,也为其他病毒的免疫学研究提供了新的参考方法。     

逆向突变型ELAV全长基因组感染性克隆的构建及体外感染性评价

在已有全长基因组感染性克隆pLGFD3-8的基础上,按照疫苗制作过程中EIAV结构基因的变化规律,对其中gag基因进行定点逆向回复改造。并在gag突变的基础上增加e一突变位点。将所改造的突变克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)以及驴单核巨噬细胞(DL),并用逆转录酶活性检测和RT-PCR方法验证其感染性。结果发现,衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变效应;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性。电镜下可见大量典型的病毒颗粒。然而单核巨噬细胞培养病毒感染滴度要明显高于驴胎皮肤细胞培养病毒滴度。驴胎皮肤细胞内嵌合克隆衍生病毒和父本克隆衍生病毒的复制动力学比较分析显示前者的复制比后者略有滞后。此结果为深入研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和疫苗保护机理奠定了基础。     

马传染性贫血病毒基因非编码区LTR嵌合克隆的构建

在已有全长感染性克隆pLGFD3-8和pD70344的基础上,根据马传贫弱毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,在LTR U3区选取特定的酶切位点对EIAV非编码区LTR基因进行了部分替换.将替换的全基因克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,用逆转录酶活性检测、RT-PCR方法及Real-time RT-PCR验证其感染性.结果发现,其衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性.电镜下可见大量典型的EIAV颗粒.pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8具有相似的复制水平,pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复制水平略高于FDD细胞.此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础.     

马传染性贫血病毒基因非编码区LTR嵌合克隆的构建

在已有全长感染性克隆pLGFD3 8 和pD70344 的基础上,根据马传贫弱毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,在LTR U3区选取特定的酶切位点对EIAV非编码区LTR基因进行了部分替换。将替换的全基因克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,用逆转录酶活性检测、RT PCR方法及Real time RT PCR验证其感染性。结果发现,其衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT PCR阳性。电镜下可见大量典型的EIAV颗粒。pLGFD9 12 嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3 8具有相似的复制水平,pLGFD9 12嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复制水平略高于FDD细胞。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。     

可感染人类的禽流感病毒A(H7N9)在中国的流行病学状况

<正>背景:2013年2月到3月期间,在中国首次发现了禽流感病毒A(H7N9)感染人类的病例。对实地调查所获得的数据进行分析后,确定了截止2013年12月1日在中国发生的H7N9病例的流行病学特征。方法:对每个被确诊为H7N9病毒感染的病例进行实地调查。如果通过实时反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、病毒分离或血清学检测,发现有     

马传染性贫血病毒减毒疫苗诱导马外周血单个核细胞白细胞介素12的转录

目的 探讨马传染性贫血病毒(EIAV)驴白细胞减毒疫苗(DLV)免疫马后,外周血单个核细胞(PBMC)中白细胞介素12(IL-12)mRNA转录水平与免疫保护应答的关系,揭示DLV的免疫保护机制。方法 应用分子克隆及实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立马PBMC中IL-12 mRNA转录水平的定量检测方法,在不同时间点定期观察4组(疫苗免疫组、阴性对照组、强毒株阳性对照组和EIAV自然感染组)12匹马PBMC中IL-12 mRNA转录水平及分布特征,同时监测体温变化等指标。疫苗株免疫动物8个月后,用EIAV强毒株攻击,观察攻击前、后IL-12 mRNA转录水平的变化。结果 DLV免疫马在免疫期内,PBMC中IL-12 mRNA转录的量略高于阴性对照组及自然感染组,但免疫后8个月用EIAV强毒株攻击,IL-12 mRNA转录量显著升高,4匹免疫马获得完全保护;强毒株阳性对照组IL-12转录量随疾病进展波动,发热期下降。结论 本研究首次证明EIAV减毒疫苗可诱导马外周血PBMC中IL-12基因高效转录,其转录水平与DLV的免疫保护密切相关。此结果在分子水平为阐明DLV的免疫保护机制提供了新的实验依据。     

T细胞IFN-g表达水平检测方法的建立及其在马传染性 贫血疫苗免疫机理研究中的应用

[目的]马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗致弱机制和免疫保护机理的研究可以为慢病毒疫苗的研究提供重要的模型.为探讨IFN-γ表达水平与疫苗保护性免疫的关系,本研究旨在建立一种准确、有效地检测EIAV感染马不同T细胞亚型表达IFN-γ水平的方法.[方法]我们将分离的马传贫弱毒疫苗免疫马(FDDV)、强毒感染马(LV)和健康马的外周血单核细胞(PBMC),体外分别经病毒(FDDV)和PMA/Inomycin激活、 BFA 阻断蛋白分泌、荧光标记马的特异性表面抗体和IFN-γ抗体等过程后,进行流式检测.[结果]疫苗免疫马产生的特异性IFN-γ水平为CD4 1.7(0.9%/CD8 6.1(1.2%,而强毒组则为CD4 0.6(0.1%/CD8 2.4(0.9%.[结论]本研究建立的多荧光参数流式细胞术同时检测细胞内IFN-γ染色和淋巴细胞亚型的方法,具有良好的特异性,稳定性和重复性.为研究EIAV弱毒疫苗免疫保护机制奠定了基础.     

逆向突变型EIAV全长基因组感染性克隆的构建及体外感染性评价

在已有全长基因组感染性克隆 pLGFD3 8的基础上,按照疫苗制作过程中 EIAV结构基因的变化规律,对其中gag基因进行定点逆向回复改造。并在gag突变的基础上增加env 突变位点。将所改造的突变克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)以及驴单核巨噬细胞(DL),并用逆转录酶活性检测和 RT PCR方法验证其感染性。结果发现,衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变效应;细胞培养上清可检测到 RT酶活性和 RT PCR阳性。电镜下可见大量典型的病毒颗粒。然而单核巨噬细胞培养病毒感染滴度要明显高于驴胎皮肤细胞培养病毒滴度。驴胎皮肤细胞内嵌合克隆衍生病毒和父本克隆衍生病毒的复制动力学比较分析显示前者的复制比后者略有滞后。此结果为深入研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和疫苗保护机理奠定了基础。     

表达马传染性贫血病毒受体和荧光素酶报告基因的293细胞系的建立

为了在体外精确、简便地测定马传染性贫血病毒(EIAV)的中和抗体和研究不同毒株与受体的亲和性,克隆了马慢病毒受体1(ELR1)cDNA并插入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建了表达载体pELR1。该载体瞬时转染293细胞后,经Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测,确认了ELR1的表达。在pELR1质粒的基础上,插入EIAV疫苗株前病毒基因组转录调控区LTR以及萤火虫荧光素酶报告基因(Luc)构建了表达载体pELR1-LTR-Luc,并转染293细胞,建立了ELR1-LTR-Luc(293-E)细胞系。该细胞系能稳定表达ELR1基因,并且能在LTR的调控下表达萤火虫荧光素酶基因。用1000TCID50的EIAV驴胎皮肤细胞疫苗株D18V13接种该细胞,24h后检测其荧光素酶活性是未接毒对照的3.15倍。同时用IFA检测证明了病毒在细胞内的增殖。EIAV强毒株L21的接毒试验显示,ELR1-LTR(293-E)细胞的萤火虫荧光素酶活性与该毒株的接毒量在10-2~10-7稀释范围内呈正相关。该细胞系传35代后,外源基因的表达特征未发生改变。该细胞系的建立为进一步开展EIAV与细胞受体相互作用以及中和抗体评价等研究奠定了重要基础。