微生物凝乳酶的研究 Ⅱ.酶学性质

从2502株菌中筛选到一株真菌Y85-8512经诱变育种,发酵物的凝乳酶活力为5000 u/g以上。对该酶的酶学性质进行了研究,其最适反应温度为70℃,酶在50℃保温半小时稳定;pH 5.0时酶活最高,pH 7.0酶几乎失活;pH 2—5,室温保持1小时,剩余酶活力为66—100%。该酶凝乳活性与水解蛋白质活性之比为4782。还与胃蛋白酶、小牛凝乳酶及毛霉凝乳酶进行了比较,初步认为该酶不同于这几种酶。     

解淀粉芽孢杆菌凝乳酶的克隆、重组表达及酶学性质

为了实现解淀粉芽孢杆菌来源凝乳酶的异源表达,并探究重组凝乳酶的酶学性质。以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,扩增得到凝乳酶编码基因proMCE,构建了重组菌株E.coliBL21(pET28a-proMCE),并成功表达了重组凝乳酶。通过Ni柱亲和层析法纯化具有活性的凝乳酶,分子量大小约为28.5kDa,纯化后比酶活达到1096.97SU/mg,纯化倍数达到4.56倍,回收率为66.51%。对该重组酶酶学性质进行了初步研究,重组凝乳酶分别在70℃、65℃表现最大凝乳酶活力与蛋白酶活力,60℃处理20min,凝乳酶活力与蛋白酶活力均被钝化80%,为热不定性酶。酶的最适反应pH为5.0。在pH5~7条件下处理后,凝乳酶活力相对稳定,能保留超过70%的活力。     

微小毛霉凝乳酶的生物合成和性质的研究

从19株真菌中筛出一株徽生物凝乳酶高产菌株,微小毛霉(Mucor pusillus)602。在含有50—60％麸皮的半固体培养基中、起始pH 5．0-6．7,28℃,培养96小时,凝乳酶最高活力为17 000u／g麸皮。补加葡萄塘、蔗糖、硫酸铵、乳清粉均对酶的产生无显著影响。酶的凝乳活力与蛋白水解活力作用的最适温度均为65℃,此酶具有较高的凝乳活力对蛋白水解活力的比值,凝乳酶的pH意定范围为4-8,凝乳酶在60℃保温5分钟,活力完全丧失。以上性质对于干酪的制造是有利的。     

产果胶酶的菌种选育及发酵条件

炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)AS 3.396经亚硝基胍和Co60r-射线诱变,获得一株高产果胶酶突变株G5512。该菌株的发酵滤液,以高酯果胶为底物的酶活力为860u／ml;以低酯果胶为底物的酶活力为1227u／ml。产酶活力水平约为原出发菌株的2—6倍。产酶最适培养条件为：起始pH4.0—4.5,30℃,72—90小时。酶作用最适条件为：高酯果胶为底物时,pH3.5,50℃;低酯果胶为底物时,pH4.5,50℃。pH稳定范围为2．0-6．5(高酯果胶)和4.5—5.0(低酯果胶)。酶在60℃保温15分钟,高酯果胶为底物的酶剩余活力71％,低酯果胶为底物的酶活力仅剩余1％。     

一株地衣芽孢杆菌产凝乳酶酶学性质研究

目的：对地衣芽孢杆菌所产凝乳酶的酶学特性进行研究。方法：在不同的温度、pH值、底物浓度、不同金属离子等条件下测定地衣芽孢杆菌产凝乳酶相对酶活力。结果：地衣芽孢杆菌所产凝乳酶最适凝乳温度为70℃;40℃以上热处理后凝乳活性有不同程度的损失,75℃热处理10min后凝乳酶活性丧失;pH值为5～8时凝乳活性随乳pH值的降低而增强,pH值为7时凝乳酶最稳定;Ca2+ 、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Mg2+、Al3+对酶活性有一定的促进作用;Li2+、Na+、Cu2+、Zn2+对酶活性有抑制作用;底物浓度最适为250 g/L、Ca2+的最适浓度为0.014 g/L。     

特异腐质霉纤维素酶的研究

由腐植土中分离到一株嗜热真菌,经鉴定为特异腐质霉(Humicola insolens Cooney etEmerson)。研究了这株菌纤维素酶的产生条件和一般性质。菌在含麦麸5％、NaNO0.3％的液体培养基(灭菌前pH7.5,灭菌后pH7.2)中,于45℃培养4天,以羧甲基纤维素钠为底物,每ml滤液酶活力为20个单位。酶作用的最适条件为:pH6.0,温度为65—70℃。该纤维素酶是一种耐热酶,热稳定性较强,70℃保温5分钟后,酶活力剩余88％。底物对该酶的热钝化有较强的保护作用,无底物存在条件下,70℃保温6小时后,酶活力仅剩余1％,而在同样的处理温度和时间,在有底物存在条件下,酶活力可剩余30％。该酶在45℃保温15小时的条件下,pH稳定范围为6.0—9.0。     

嗜冷性海洋微生物产蛋白酶的研究

从210株海洋细菌中筛选出30株产蛋白酶活力较高的菌株。以N₁为出发菌,用UV诱变处理,获得突变株。其中的N_1-3。菌株最适生长温度为20℃;在21℃下培养44小时,产酶最高。酶反应最适温度为50℃,最适pH8.0。30℃以下酶活稳定。     

影响微小毛霉凝乳酶活力的因素

介绍影响微小毛霉凝乳酶活力的几个因素．该微小毛霉凝乳酶的最适ｐＨ在５．４～７．０范围;在ｐＨ２～７之间酶活保持稳定;凝乳酸最适温度在２５～７０℃,并随温度的增高酶活增大;６０℃处理１０ｍｉｎ酶活损失６８％,并随时间的延长酶活损失加大;Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋对酶有激活作用,Ｎａ＋、Ｃｕ２＋对酶有抑制作用。     

脂肪酶产生菌Geofrichum sp. AS 2.1135产酶条件及酶一般性质的研究

在92株能同化油的地霉属菌株中,Geotrichum sp. AS2．1135菌株产脂肪酶活力为50—60u／ml,对其产酶条件的研究表明,不饱和长链脂肪酸和油类有利于酶的形成。在4％豆饼粉作为有机氮源的培养基中,加入0．2％尿素,酶活力显著增加,酶活达150u／ml。用聚乙二醇橄榄油乳化系统测定酶的作用最适pH为8．0,最适温度为4O一42℃。在pH4一9时5℃下存放24小时,或在pH 5和8时45℃保持15分钟,酶活力不变。     

苯甲酸1，2-双加氧酶高活力菌株的筛选和发酵条件的研究

从176株细菌中,筛选出苯甲酸1,2-双加氧酶的高活力菌株假单胞菌(Pseudomonas)137。进行了该菌产酶的发酵条件试验。产酶的最适温度为32℃,最适起始pH为6．5—7．0。葡萄糖、麦芽糖和甘油对产酶有明显的抑制作用,苯甲酸钠对产酶有促进作用。氨态氮对菌体生长和产酶是必需的。琥珀酸钠是酶形成的有效诱导物,采用0．1％苯甲酸钠和0．2％琥珀酸钠培养基(pH6．5—7．0),于32℃振荡培养72小时,可获得高活力的苯甲酸1,2-双加氧酶,每克菌体酶活力可达5-8单位。     

3-氰基吡啶水合酶的反应条件及影响因子

研究了芳腈水合酶催化水合3-氰基吡啶生成尼克酰胺的反应条件及影响因子.酶反应的最适pH为8.0,最适温度为25℃.酶在pH8.5于25℃保温4小时或在25—30℃于pH8.0保温3小时是稳定的.反应液中加入Fe~(3+)(1.5 mmol/L)可使酶活力增加 50%,而加入NH_4~+(300 mmol/L)则使酶活降低了67%.Ag~+和 Hg(2+)”强烈地抑制酶反应活性,在浓度均为 5mmol/L时,抑制率分别为99.7%和100%.NaCN(50 mmol/L)和苯甲腈(100 mmol/L)对酶活性的抑制率分别为78%和85%.该酶作用于 3-氰基吡啶的Km为62.5 mmol/L,V_(max)为85.8 μmol·min~(-1)·mg~(-1).     

一株产阿魏酸酯酶丝状真菌的分离鉴定及其粗酶性质研究

利用平板透明圈法,筛选分离到37株具有阿魏酸酯酶活性的丝状真菌,其中1株编号为HA4087的菌株具有较强的产阿魏酸酯酶能力。经形态学观察、18S rDNA和ITS序列鉴定为互隔交链格孢霉。对该菌株所产阿魏酸酯酶的粗酶性质进行了初步研究,结果表明,在发酵培养基中发酵粗酶活力为86 mU/mL,最适作用温度为55℃,最适pH值为5.5;在55℃保温30 min后酶活力仍为90%以上;在pH4.5-6.5范围内稳定性较好,酶活仍为85%以上。试验获得了产高酶活阿魏酸酯酶的菌株,为阿魏酸酯酶的工业化应用提供前提。     

产碱菌外切异麦芽三糖水解酶的产生和性质

从污染的右旋糖酐溶液中分离出一株外切异麦芽三糖水解酶(Exo-isomaltotrio-hydrolase,1,6-α-D-Glucan isomaltotriohydrolase EC 3.2.1.95)产生菌,经鉴定为产碱菌(Alcaligenes sp.).研究了酶的产生条件和基本性质.产酶最适培养基组成(%):右旋糖酐1.5、鱼粉蛋白胨1、酵母抽提物0.1、牛肉膏0.3、甲醇2,pH8.0,250ml三角瓶中装20ml培养基,于26℃200r/min旋转摇床上振荡培养48小时.酶的最适作用温度和pH分别为50℃和p H6.5—7.5,在pH5.0—10.6范围内稳定.在40℃保温24小时酶活力基本不变,50℃保温8小时剩余酶活力为71.8%,保温24小时剩余酶活力为44.2%,在55℃酶活力的半寿期为10 小时.金属离子Hg^(2+)、Ag^+对酶强烈抑制.水解右旋糖酐的终产物为异麦芽三糖,酶的作用方式为外切型.     

耐低温厌氧蛋白酶产生菌B-25的选育及产酶条件研究

从公园池塘污泥中分离到一株性状优良、耐低温的厌氧蛋白酶产生菌B-25,经形态、生理生化特性、16SrDNA序列分析鉴定为双酶梭状芽孢杆菌（Clostridium bifermentans）。对其最适产酶条件进行了初步研究,该菌培养96h时酶活力达到高峰,最适初始pH为7．5,在16℃、22℃、30℃培养酶活较高,该酶不耐高温,60℃以上酶活全部丧失。     

Isolation of psychrotolerant anaerobic strain B-25 producing protease and its enzymatic properties

从公园池塘污泥中分离到一株性状优良、耐低温的厌氧蛋白酶产生菌B-25,经形态、生理生化特性、16S rDNA序列分析鉴定为双酶梭状芽孢杆菌(Clostridium bifermentans).对其最适产酶条件进行了初步研究,该菌培养96 h时酶活力达到高峰,最适初始pH为7.5,在16℃、22℃、30℃培养酶活较高,该酶不耐高温,60℃以上酶活全部丧失.     

一步法发酵菊芋产乙醇菌种的筛选及产酶条件、酶学性质的研究

从腐烂的菊芋及实验室保存的菌种中,选育到一株发酵菊芋产乙醇的菌株克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus Y1。利用正交实验法对克鲁维酵母产菊粉酶的培养基组成及培养条件进行优化,确定培养基组成（g/L）为：菊粉40,酵母粉4,蛋白胨4,尿素1;初始pH5．0,温度30℃,150r／min条件下培养达到最佳产酶效果（57U／mL）。该菌株所产菊粉酶的性质测定结果表明：以菊粉为底物,该菊粉酶最适反应温度为55℃,在60℃以下稳定性很好,高于60℃时酶迅速失活;最适pH为5．0,pH4．6—5．2范围内酶稳定性很好;该酶属于外切型菊粉酶,体积分数为8％的乙醇对酶活力基本没有影响。     

斜卧青霉A10产纤维素酶的酶学性质研究

以斜卧青霉（Penieillium decumbens）A10为出发菌株,经450Gy ^60Coγ-射线诱变处理,选育出一株具有较高纤维素酶活力且传代稳定的正突变株A50,发酵60h后,其CMC酶活和滤纸酶活分别为27．28IU／mL和1．98IU／mL,较出发菌株A10分别提高了33．2％和45．59％。对突变株A50的产酶组分进行研究,通过SDS—PAGE电泳分析,从蛋白质水平上证明突变株A50确实是A10在遗传物质上发生改变的菌株,其CMC酶活最适作用pH值为4．0,最适作用温度为60℃;而滤纸酶活的最适作用pH值为5．2,最适作用温度45℃,二者在一定范围内具有较高的稳定性。     

热带假丝酵母长链二(脂)酰辅酶A合成酶的形成及性质

热带假丝酵母(Candida tyopicalis)具有不同碳链的二(脂)酰CoA合成酶的活力,原始菌No．1230的十二二酰CoA合成酶的活性较其突变株U3-21。高近一倍。生长碳源对酶的形成有一定的影响。十二二酰CoA合成酶需有ATP、CoASH才显示活性。酶作用的最适pH在6—8,最适温度为30℃。该酶耐热性极差,50℃,5分钟酶活全部丧失。ADP、AMP、KF、Zn2+ 及 8-羟基喹啉、2,4-二硝基苯酚、高浓度的EDTA和尿素对酶活性有抑制作用。     

曲霉木聚糖酶发酵条件与性质

从实验室培养污染物上分离出一株产木聚糖酶活力高的曲霉（ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＳｐ．）Ａ３菌株。研究了其发酵过程,该菌经３０℃,培养９６小时,酶活力可达３２０ＩＵ／ｍｌ,研究了碳源,氮源,发酵起始ｐＨ值及通风量对产酶的影响。酶的最适反应温度为５５℃,最适ｐＨ值为４．４。在不同温度下保温１小时,测得该酶的半失活温度为５１℃。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达与酶学性质

随着大型褐藻生产燃料乙醇以及褐藻寡糖重大药用价值的发现,褐藻胶裂解酶成为国内外多个领域的研究重点。文中对解藻酸弧菌上与褐藻胶降解相关的5个基因分别进行克隆表达,通过SDS-PAGE和酶活性定量测定,发现该基因簇中的4个基因有降解褐藻胶活性。对酶活最高的rAlgV3进行了诱导条件的优化、酶蛋白纯化及酶性质研究,发现优化诱导条件后重组酶rAlgV3的酶活由2.34×10~4 U/L上升为1.68×10~5 U/L,比优化前提高了7.3倍;对酶性质进行表征发现该酶在4–70℃均有活性,最适反应温度为40℃,在4–20℃酶相对稳定;该酶在pH 6.5-9.0环境下均有较高的酶活,最适pH为8.0;pH稳定性好,在pH 4.5–9.5环境下可以稳定存在;适量的NaCl浓度和Fe~(2+)、Fe~(3+)等离子具有促进酶活的作用,SDS和Cu~(2+)离子可明显抑制酶活力。对该酶的底物特性的研究发现,该酶不仅可以降解褐藻胶中的Poly-M片段,也能降解Poly-G片段,具有广泛底物特性;其降解海藻酸钠主要释放二糖和三糖,是一种内切酶。该酶对于第三代燃料乙醇的发展及褐藻寡糖的生产具有重要作用。