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利用选择性培养基筛选大肠杆菌自然突变菌株,经噬菌体P1转导和蛋白质互补试验,发现一株突变体(LCH001)的突变基因发生在编码RNA聚合酶β′亚基的rpoC基因上,经DNA序列分析,发现突变位点发生在第3406个碱基上,由G变成了T,导致编码的氨基酸由甘氨酸(GGT)变成半胱氨酸(TGT)。体内转录试验表明该突变RNA聚合酶转录严谨型启动子控制基因的活性显著降低,其β-半乳糖苷酶的活性是野生型菌株的18%,而转录非严谨型启动子控制基因的活性显著提高,其β-半乳糖苷酶的活性约是野生型菌株的5倍。研究结果对探讨RNA聚合酶结构与功能的关系以及RNA聚合酶在细菌严谨反应过程中的作用具有重要意义。 相似文献
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在酵母体内用RNA聚合酶II表达大肠杆菌tRNA^Sec基因 总被引:1,自引:1,他引:0
我们将大肠杆菌的硒代半胱氨酸tRNA基因(SelC基因)连接到分泌型表达质粒PVT102U-αMFL中,并调整好阅读框架,使蛋白翻译的终止密码子位于SelC基因的下游。将该质粒转化酵母,通过SDS-PAGE分析,在SD液体培养基中检测出7 ̄8kd的蛋白条带,这与理论值是相符合的。同时,我们抽提出酵母的总RNA用互补与该tRNA TψC茎环区的21-mer寡核苷酸,经5'标记后作为探针进行North 相似文献
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RNA病毒RNA聚合酶的研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
丁清泉 《Virologica Sinica》1998,13(2):107-113
自然界仅有RNA病毒以RNA作为基因载体。依赖于RNA的RNA聚合酶在这种病毒的增殖复制期起到了非常重要的作用。它一方面以病毒RNA为模板复制子代病毒的基因,另一方面也将病毒增殖期间需要的蛋白质和酶类的基因转录成为mRNA,也就是说它担负了复制酶和转... 相似文献
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将2种表达质拉pEGMD(含rpoD基因)和pETF(含rpoS基因)转化到BL21(DE3)菌株中,培养菌体。破碎细胞,用盐酸抓溶解包含体,经DEAE-纤维素柱层析,SDS-PAGE检测可得纯化σ的蛋白。通过紫外分光光度法测定蛋白浓度,实验表明σ38蛋白的得率为菌体温重的0.27%,σ70蛋白的得率为菌体湿重的0.06%。 相似文献
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【目的】本研究通过原子力显微镜(AFM)力谱技术研究了大肠杆菌启动子与RNA聚合酶(RNAp)间的相互作用,目的是建立一种高效的体外表征启动子的新方法。【方法】优化了用于单分子AFM力谱分析的蛋白固定化策略,建立AFM力谱分析启动子的策略,以缺失识别启动子序列的σ亚基核心RNA聚合酶(RNAp-C)为对照,研究启动子/RNAp间相互作用的特异性。最后比较了序列较典型的Ls1启动子和缺失–10区的Ls2启动子的力谱。【结果】基于建立的方法,验证了Ls1与大肠杆菌RNAp结合的特异性,其相互作用力为(331.10±5.10)p N。与Ls1相比,Ls2启动子与RNAp结合显著减少。利用启动子探针质粒,以报告基因cat的表达产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的酶活验证Ls1、Ls2启动子强度,分别为(181.70±4.10)、(0.30±0.20)U/mg。【结论】本研究建立的基于AFM力谱技术的启动子分析技术,是一种高效的、直接定量表征启动子活性的新方法。 相似文献
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RNA病毒一般传播迅速,给人类和自然造成巨大危害和威胁.许多RNA病毒的结构蛋白在基础研究和应用方面已日趋完善.相比之下,就非结构蛋白(NS)所做的研究较少,存在许多未知问题.在这些非结构蛋白中,病毒自身编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)对病毒的复制起关键作用.对RdRP的研究不仅使对病毒RNA复制的机制更精细明了,且有可能提供新的抗病毒靶标和诊断试剂.本文对RdRP特别是动物RNA病毒RdRP的结果与功能作一综述. 相似文献
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RNA沉默是一种由21.26nt RNA分子介导的真核生物体内普遍存在的以序列特定性行为抑制基因表达的保守途径。RNA沉默最显著的特征在于它是一种非细胞自发的过程,即在植物和小杆线虫(Caenorhabditis elegans)中RNA沉默均能被局部诱导,随后将沉默状态传导至整个生物体。RNA沉默的系统传导特性表明,RNA沉默途径中存在着可移动的信号分子。就RNA沉默信号传导的特征和可能的信号分子等做一综述。 相似文献
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用化学方法合成编码2个大肠杆菌tRNALeu(tRNALeu1和tRNALeu2)的基因和T7启动子,分别克隆到pUC19载体上,并在纯化的T7 RNA聚合酶的体外转录系统中转录出不含修饰核苷酸的tRNALeu.在T7转录体系中,亚精胺对转录有负影响.在最适转录条件下,可以得到有活力的RNA转录物的量是模板DNA的250倍左右.在大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶的催化下,2种经体外转录产生的未修饰等受体tRNALeu(tRNALeu1和tRNALeu2)的亮氨酸接受能力基本相同,但只有从体内纯化对应的tRNALeu的四分之一左右,表明修饰核苷酸在tRNALeu氨酰化过程中起着较为重要但非关键的作用. 相似文献
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丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)研究进展 总被引:2,自引:0,他引:2
由于缺乏合适的HCV感染细胞模型,严重制约了HCV复制,特别是HCV复制的关键因子依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的研究.对HCV序列比较分析并通过异源表达证明NS5B是HCV复制的RdRp.NS5B C端疏水性氨基酸区域以及NS5B与细胞膜形成复合体等影响NS5B溶解性.在合适的反应条件下NS5B可以多种RNA分子为模板催化RNA复制,特别是能有效复制HCV全长(+)RNA.高浓度GTP激活HCV RdRp活性.NS5B N/C端缺失突变和保守性A、B、C区中的点突变影响RdRp活性,但D区345位精氨酸突变为赖氨酸时RdRp活性明显升高.HCV RdRp的发现及其功能研究为HCV药物研究提供了新型靶标. 相似文献
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细菌的转录过程是一个由多种分子共同调控的复杂过程,其中RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)是催化转录合成RNA的重要酶.作为RNAP中一个独立的亚单位,σ因子(sigma factor)在转录起始过程中起着至关重要的作用.最近的研究表明σ因子参与了转录起始的各个过程,包括启动子的定位、启动子的解链、起始RNA合成、脱离启动子等过程.由于其在细菌转录过程中的重要作用,σ因子正在成为抗菌药物研究的新靶点.本文对σ因子的结构、分类、功能以及以它为中心的调控网络的研究进行综述. 相似文献
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【背景】大肠杆菌中Small RNA EsrE调控琥珀酸脱氢酶的表达并影响细胞生长,对其调控机制的探究有利于加深EsrE对细胞生长影响的认识。【目的】探究大肠杆菌Small RNA EsrE的转录调控机制。【方法】通过双质粒报告系统筛选转录调控因子,并通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobilityshiftassay,EMSA)和qRT-PCR研究方法验证转录调控因子。【结果】双质粒报告系统证明RNA聚合酶亚基σ~(32) (RpoH)上调P_(esrE),β-羟酰-ACP脱水酶(FabZ)下调PesrE。EMSA结果和体内实验显示RpoH结合P_(esrE)片段,FabZ不结合P_(esrE)片段。【结论】RpoH直接结合启动子序列参与调控,FabZ以其他方式间接参与Small RNA EsrE的转录调控。 相似文献
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研究鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的分子机制,利用分子对接方法获得了9种鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的结合模式、结合位点、对接能和抑制常数等信息,并对鹅膏毒肽的毒性与结构间的构效关系进行了考察。结果表明:利用分子对接方法获得的鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的信息与实验结果相一致;不同R2取代基引起毒素与聚合酶II结合能力强弱不同,从而导致鹅膏毒肽分子间的毒性差异。结果证实了运用分子对接方法探索多肽分子与蛋白质相互作用的可行性,为在分子水平上研究多肽与蛋白质的相互作用开拓了新的思路。 相似文献
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真核生物基因转录活性的调控过程十分复杂,许多蛋白质在这一过程中发挥作用。酵母中对RNA聚合酶Ⅱ转录活性的调控可分为以下4种类型:(1)阻遏物的直接抑制作用;(2)阻遏物的间接抑制作用;(3)激活物的直接活化作用;(4)激活物的亚细胞定位调节作用。本文拟就近来酵母中RNA聚合酶Ⅱ转录活性的上述4种调控机制的研究进展作一综述。1 阻遏蛋白的直接抑制作用1.1半乳糖代谢作用的调控 目前对于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)利用半乳糖(包括摄取、转运、代谢等)的过程以及相关酶基… 相似文献
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我们将大肠杆菌的硒代半胱氨酸tRNA基因(SelC基因)连接到分泌型表达质粒PVT102U-αMFL中,并调整好阅读框架,使蛋白翻译的终止密码子位于SelC基因的下游.将该质粒转化酵母,通过SDS-PAGE分析,在SD液体培养基中检测出7~8kd的蛋白条带,这与理论值是相符合的。同时,我们抽提出酵母的总RNA用互补与该tRNATC茎环区的21-mer寡核苷酸,经5′标记后作为探讨进行Northernblot。结果有两条较强的条带和一条较弱的条带,较强条带中一条相当于790nts左右,另一条相当于370nts左古,根据组建的表达型质粒结构资料推测790nts左右的条带是由RNA聚合酶II转录的未被加工的前体;370nts左右的条带是5′端被加工而3′端未被加工的分子,较弱的条带则是相当于90nts左右的成熟tRNA分子。因此,我们认为RNA聚合酶II可以转录tRNA基因。由于实验用酵母的3′内切核酸酶含量较低,致使带长尾巴的tRNA前体3′端加工速度缓慢。 相似文献
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