猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的稳定性研究

以本实验室建立的CSFV39-PKl5持续感染细胞模型为实验材料，综合运用免疫荧光、RT-PCR、流式细胞仪，对其稳定性进行研究。实验结果均表明，该细胞模型有着良好的稳定性。即使在连续传至128代的CSFV39-PKl5传代细胞中，CSFV仍持续存在：呈免疫荧光抗体反应阳性和RT-PCR检测阳性。同时，该细胞与正常的PK-15细胞相比，细胞周期无显著差异。通过同段序列的同源性比较，发现CSFV39与CSFV石门株的同源性最高，达99．02％。     

非洲猪瘟病毒多样性

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种急性、高度致死性传染病.该病在全世界多个地方流行,导致该病流行的原因之一是缺乏有效的预防及治疗药物、疫苗等.尽管ASFV基因总的突变率相对其基因组来说较低,但是,与其它病毒相比,其基因突变总数则相当巨大.研究发现ASFV的多个基因具有高突变率的特性,表现为基因多样性,此外,由于该病毒为核质大DNA病毒,编码大量蛋白,其抗原也表现为多样性.本文总结了 ASFV基因多样性和抗原多样性,分析其发生原理并综述了最新研究成果,以期为研究ASFV病毒遗传演化、开发疫苗及指导疫情防控提供思路.     

非洲猪瘟病毒的分子生物学研究进展

非洲猪瘟是一类动物传染病,致死率高达100%,在我国虽未发现该病,但一旦发生会给畜牧养殖业带来巨大经济损失。文中概述了非洲猪瘟病毒的分类、形态、基因组特征、主要结构蛋白,以及分子生物学诊断技术的研究进展。为进一步研究该病毒的复制机理、毒力、致病机理及疫苗的开发提供参考依据。     

稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系的建立

旨为建立稳定表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P54蛋白的Vero细胞系,将ASFV-P54基因与绿色荧光基因Azami Green的融合基因片段,将其克隆至慢病毒载体pLV-puro中构建重组慢病毒质粒pLV-ASFV-P54-AG,将该质粒与慢病毒包装质粒pH1和pH2共转染HEK-293V细胞,包装表达ASFV-P54蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染Vero细胞,筛选出一株稳定表达ASFV-P54蛋白的Vero细胞系,命名为Vero-AG-ASFV-P54。间接免疫荧光试验表明,该细胞系能够与P54多克隆抗体反应;经波兰国家兽医研究所进一步验证,结果显示,该细胞系与ASFV抗体阳性血清也能发生反应,并且与阴性血清无反应。结果表明,Vero-AG-ASFV-P54细胞系能够稳定高效的表达具有生物活性的ASFV-P54蛋白。     

非洲猪瘟研究进展

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染家猪或野猪后引发的一种急性、烈性传染病,主要通过病猪及其周围环境传播,蜱是中间宿主。1921年该病首次暴发于非洲肯尼亚,2018年8月传入我国,目前已有24个省级行政区发生疫情。非洲猪瘟病毒主要经呼吸道和消化道进入猪体内,感染靶细胞主要是单核-巨噬细胞,目前受体还不明确。非洲猪瘟病毒是单分子双链DNA病毒,长度为170~190kb,编码150~200种蛋白,包括多种免疫调控蛋白,可以抵抗机体免疫。非洲猪瘟病毒疫苗研究较多,包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和基因疫苗等,但迄今这些疫苗都不能保护家猪免受非洲猪瘟病毒感染。今后需要对非洲猪瘟病毒及其发病机制做详细系统的研究,为开发有效防治方案提供资料。     

非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种急性、热性、高度接触性动物传染病,其病原为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征,易感猪群病死率高达100%。为了建立一种基于合成肽技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体血清学检测方法。本研究根据ASFV p30、p54和p72三种重要抗原设计3条合成肽,以此为包被抗原建立了ASFV间接ELISA抗体检测方法,并验证其敏感性、特异性、稳定性以及与进口试剂盒的符合率。结果显示,建立的间接ELISA方法的敏感性为91.4%,特异性为98.1%,批内和批间变异系数分别为3.7%～10.1%和4.7%～14.9%。与进口试剂盒比较,符合率为92.9%。结果表明该方法检测结果准确性高、且稳定性好,可检测ASFV特异性抗体。     

乙型肝炎病毒假病毒体外感染树鼩原代肝细胞模型的建立

目的：建立乙型肝炎病毒假病毒（HBVpp）体外感染树鼩原代肝细胞（PTH）模型。方法：通过肝脏原位两步灌注法分离PTH并对其冻存方法进行优化,通过共转染293T细胞生产基于慢病毒包装系统的HBVpp并考察其感染的种属和组织特异性。结果：通过肝脏原位两步灌注法分离了PTH,并优化了PTH冻存液的配方;包装的HBVpp具有与HBV真病毒类似的感染种属和组织特异性。结论：该模型的建立对深化HBV进入肝细胞机制的研究具有重要意义。     

人免疫缺陷病毒假病毒药物筛选模型的构建及其应用

目的:构建人免疫缺陷病毒(HIV)假病毒模型,用多种HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂作用于该模型,以检测其是否能有效用于HIV抑制药物的筛选。方法:通过载体改造获得最终慢病毒载体puc18-NL4-3-LUC-stop,其中含有萤光素酶基因,将该载体与包膜质粒VSV-G共转染293FT细胞,包装产生HIV假病毒,在假病毒包装和病毒感染293FT细胞的过程中加入蛋白酶和逆转录酶抑制剂,通过检测感染细胞中萤光素酶的表达来检测该模型的有效性,并利用此模型检测药物的抗病毒效果。结果:将HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂作用于该假病毒模型时发现萤光素酶的表达得到很大程度的抑制。结论:建立了HIV假病毒药物筛选模型,该模型以萤光素酶基因作为报告基因,快速灵敏,在抗HIV药物筛选中有一定的应用价值。     

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的建立

采用猪瘟病毒野毒珠(CSFV39)感染猪肾传代细胞系PK-15,经连续传79代,建立了稳定的病毒持续感染细胞模型,获得CSFV39-PK15细胞株.用免疫荧光、RT-PCR检测、透射电镜跟踪观察了CSFV39-PK15细胞株连续传代中病毒在细胞内的存在情况.结果表明第9,29,79代细胞仍有猪瘟病毒存在,表现出病毒持续感染的基本特征.这为深入研究猪瘟病毒持续感染机理奠定了基础.     

非洲猪瘟防控及疫苗研发：挑战与对策

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种接触传染性、广泛出血性猪烈性传染病,最急性和急性感染死亡率高达100%。自2018年8月我国发生首起非洲猪瘟疫情后,3个多月内,已有18个省份累计暴发69起,给我国养猪业造成了沉重打击。从目前非洲猪瘟全球流行态势及世界各国防控经验来看,我国非洲猪瘟防控和根除面临的形势不容乐观,亟需安全有效的疫苗用于该病的防控。文中结合当前非洲猪瘟病原学最新研究成果,系统总结了非洲猪瘟防控策略、疫苗研究进展及其面临的挑战,重点分析了疫苗研发历程、存在的问题、未来发展方向以及商业化应用所面临的关键科学问题,以期为我国非洲猪瘟防控及病原和疫苗研究提供借鉴。     

Regulation of antiviral immune response by African swine fever virus (ASFV)

African swine fever (ASF) is a highly contagious and acute hemorrhagic viral disease with a high mortality approaching 100% in domestic pigs. ASF is an endemic in countries in sub-Saharan Africa. Now, it has been spreading to many countries, especially in Asia and Europe. Due to the fact that there is no commercial vaccine available for ASF to provide sustainable prevention, the disease has spread rapidly worldwide and caused great economic losses in swine industry. The knowledge gap of ASF virus (ASFV) pathogenesis and immune evasion is the main factor to limit the development of safe and effective ASF vaccines. Here, we will summarize the molecular mechanisms of how ASFV interferes with the host innate and adaptive immune responses. An in-depth understanding of ASFV immune evasion strategies will provide us with rational design of ASF vaccines.     

非洲猪瘟病毒CP204L基因的原核表达与单抗制备

由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的非洲猪瘟(ASF)给我国养猪业带来了不可估量的经济损失,严重阻碍了我国养猪业的发展,研发ASFV快速诊断试剂是目前最重要的内容之一。CP204L基因编码ASFV结构蛋白p30。本研究以克隆ASFV的CP204L基因为基础,通过基因重组技术,加入His标签,将构建的重组质粒命名为pET-28a-CP204L。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,37℃经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达6h,表达蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blot检测。重组蛋白纯化后免疫小鼠制备筛选单克隆抗体,Western Blot和IFA验证单抗的结合特异性。结果表明,重组的pET-28a-CP204L诱导后表达蛋白为30kD,以不可溶性包涵体形式存在;表达蛋白利用His标签进行纯化,获得纯化蛋白2mg,单克隆抗体筛选获得5株IgG亚型的ASFV p30蛋白的单抗,且均具有良好的结合活性。本研究为发展ASFV检测方法提供了基础。     

Embryo transfer as a means of controlling the transmission of viral infections: V. the in vitro exposure of zona pellucida-intact porcine embryos to African swine fever virus

African swine fever virus (ASFV) was detected on or in zona pellucida-intact porcine embryos that had been exposed to 10^6.6 hemadsorption dose 50%/ml (HAdD₅₀/ml) of ASFV for 18 hours, washed and then cultured. Ninety-five percent of the embryos retained infectious virus after washing. Treating the embryos with papain, EDTA or ficin had no effect on the retained virus, whereas treating them with trypsin or pronase reduced the number of embryos carrying detectable virus (30% instead of 95%) and lowered the amount of virus on the embryos. It has not yet been determined whether ASFV enters the embryonic cells but the evidence suggests that most of the virus, and possibly all of it, is bound to the zona pellucida.     

非洲猪瘟病毒的生物学特性与疫苗研制的难点

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪烈性传染病,是全球养猪业的"头号杀手",强毒株引发的超急性和急性感染死率高达100%。2018年8月ASF首次传入我国,截止2019年6月6日,已有32个省份累计暴发137起疫情,给我国社会、经济构成巨大威胁。ASF疫苗的研制始于20世纪60年代,但均以失败而告终,其主要原因是对ASFV生物学特性缺乏深入的研究。有效控制当前ASF疫情扩散、研制安全有效的疫苗将是我国面临的巨大挑战。本文对ASFV形态与基本结构、传播途径、致病机制、基因组及编码蛋白、入侵机制、免疫逃逸等生物学特性进行了概述,并分析了当前疫苗研制面临的难点,以期为我国有效控制ASF疫情及病原研究提供参考。     

猪气喘病实验猪模型的建立

目的 研究建立猪气喘病人工发病模型。方法 将分离得到的一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)Js株进行各种试验鉴定,证实其为Mhp强毒株。每头猪肺内接种Js株培养物2ml,15～25d后观察临床症状和病理变化,采集病变组织,经冻干制成攻毒用组织毒。安检合格,批号为20000324。给15头小梅山二元杂交猪分别气管内注射以KM₂培养基作10^-2、10^-3、10^-4和10^-5稀释的强毒,每头猪5ml,对照组注射培养基。攻毒后25d观察试验猪临诊症状,X线透视,记录病理变化。结果 10^-2、10^-3、10^-4稀释的强毒试验组猪均出现了典型的猪气喘病临床症状和病理变化。结论 人工发病试验测得Mhp Js株组织强毒接种气管内注射最小发病剂量为10^-4稀释5ml,正式试验人工发病可用100个最小发病剂量即强毒冻干物1:100稀释气管内注射5ml,可确保攻毒成功。     

非洲猪瘟病毒VP73基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达

参照Genebank中非洲猪瘟VP73基因序列,人工合成的VP73全基因克隆至pMD 18-T克隆载体质粒中,采用PCR扩增得到1188 bp的VP73基因;将VP73基因片段亚克隆插入pBAD/Thio表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP73基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了非洲猪瘟病毒VP73基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP73蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002 %的L-Arabinose进行诱导,4 h后表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子量约60 kDa,表达产量约占菌体总蛋白的30％。Western blotting和ELISA检测表明,表达的融合蛋白能与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应,说明表达获得的产物为非洲猪瘟病毒VP73融合蛋白,且具有良好的反应原性,这为应用该表达蛋白抗原制备ASFV免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。     

Mechanism of collapse of endoplasmic reticulum cisternae during African swine fever virus infection

Infection of cells with African swine fever virus (ASFV) can lead to the formation of zipper-like stacks of structural proteins attached to collapsed endoplasmic reticulum (ER) cisternae. We show that the collapse of ER cisternae observed during ASFV infection is dependent on the viral envelope protein, J13Lp. Expression of J13Lp alone in cells is sufficient to induce collapsed ER cisternae. Collapse was dependent on a cysteine residue in the N-terminal domain of J13Lp exposed to the ER lumen. Luminal collapse was also dependent on the expression of J13Lp within stacks of ER where antiparallel interactions between the cytoplasmic domains of J13Lp orientated N-terminal domains across ER cisternae. Cisternal collapse was then driven by disulphide bonds between N-terminal domains arranged in antiparallel arrays across the ER lumen. This provides a novel mechanism for biogenesis of modified stacks of ER present in cells infected with ASFV, and may also be relevant to cellular processes.