人T细胞白血病病毒I型的研究现状

人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I）是一类在人体可引起严重疾病的逆转录病毒。有数据表明国内局部地区存在小的流行,本文从病原学、流行病学、监床表现、实验室诊断等方面对其作一综述。     

重组人α降钙素基因相关肽的克隆与表达

通过PCR方法从人类基因组中扩增出编码hαCGRP的片段,将该片段定向克隆到pET-32a( )载体上,构建DET-hαCGRP重组质粒．转化E．coli JM109菌株,利用酶切和测序方法筛选后,经IPTG诱导再转化E.coli BL21trxB(DE3)pLysS菌株.SDS-PAGE和Western Blot分析表达产物,最后通过扩张蟾蜍肠系膜微循环血管实验来检测重组hαCGRP扩张血管的活性,结果表明,重组质粒含hαCGRP成熟肽编码基因序列(111bp),符合预想结果;表达出21kD的融合蛋白,且主要以可溶性形式存在,其粗提物具有扩张血管能力,重组hαCGRP的成功表达为下一步纯化及研制基因工程药物奠定了重要基础。     

人类T细胞白血病病毒I型pX基因反式调节和致白血病机理的研究进展

人类Ｔ细胞白血病病毒Ｉ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）是成人Ｔ细胞白血病（ＡＴＬ）的病因。ＨＴＬＶ－Ｉ基因组中的ｐＸ基因区域编码ｐ４０＾ｔａｘ和ｐ２７＾ｒｅｘ蛋白,前者可反式激活病毒的ＬＴＲ和ＩＬ－２Ｒ及ｃ－ｆｏｓ、ＴＧＦβ１等细胞基因,加强转录过程,在白血病发生中发挥重要作用。ｐ２７＾ｒｅｘ蛋白则在转录后水平进行反馈性调节。白血病的发生机理是多因子参加的多步骤过程。     

人Leptin基因的cDNA的克隆和表达

克隆人Leptin基因的cDNA并获取表达的Leptin蛋白,为进一步研究新的Leptin相关蛋白打下基础。以人基因组DNA为模板,用引物悬挂延伸PCR法,克隆与6个组氨酸（6×His）密码子相连的人Leptin基因的cDNA,并将其克隆到体外表达载体pIVEX23MCS上,通过体外快速翻译系统(Roche公司的RTS500环状模板试剂盒和RTS500 ProteoMaster仪器)在体外表达了带有6×His的Leptin融合蛋白。经SDSPAGE及Western blot方法鉴定,融合蛋白大小正确,有172个氨基酸,分子量为1946kD,具有特异的抗原性,且主要以可溶形式存在于反应液上清中。     

小菜蛾化学感受蛋白基因PxylCSP1的克隆和表达

利用RT-PCR和RACE技术克隆到小菜蛾Plutella xylostella 化学感受蛋白（CSP）基因PxylCSP1（GenBank登录号: FJ361903）,其核苷酸序列全长405 bp,编码134个氨基酸残基,预测N-末端包含19个氨基酸组成的信号肽序列,估测其成熟蛋白分子量为13.56 kD,等电点为6.12。该基因编码氨基酸序列和其他鳞翅目昆虫CSP的氨基酸序列比对同源性较高（70%~80%）。RT-PCR结果表明PxylCSP1不仅存在于小菜蛾的触角中,还存在于头、足、腹和翅中。Real-time PCR结果表明PxylCSP1的表达水平因被测小菜蛾的性别、日龄、组织不同和交配与否而异。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

以ILTV基因组为模板 ,利用PCR特异扩增出gB基因 ,定向克隆到中间质粒载体pY_α ,构建了中间质粒pY_α_gB。然后以中间质粒pY_α_gB为模板 ,扩增出含有人结核分枝杆菌启动子hsp70基因和堪萨斯分枝杆菌α信号肽基因的hsp_α_gB片段 ,回收补平后与穿梭表达载体pRR3平端连接 ,从而构建大肠杆菌_分枝杆菌穿梭表达质粒pR_α_gB。再将其电转化至耻垢分枝杆菌M .smegmatismc2 15 5 ,ELISA检测表明重组菌株M .smegmatismc2 15 5 (pR_α_gB)的表达产物具有很好的反应原性。Westernblot检测说明gB基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。鸡胚中和试验结果表明该重组菌株可以中和 1个剂量EID50 的ILTV强毒 ,能够保护SPF鸡胚抵抗强毒攻击     

rhGM—CSF／LIF融合蛋白基因的克隆及表达

利用基因重组技术,人工构建了一个编码五肽Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｓ的基因接头,将ＧＭ－ＣＳＦ和ＬＩＦ的ｃＤＮＡ相连而构成融合基因,将融合基因载入原核表达载体ｐＢＶ２２０后转化大肠杆菌,经热诱导后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹反应鉴定证实获得ｒｈＧＭ－ＣＳＦ／ＬＩＦ融合蛋白（简称ｒｈｇＭ－ＬＩＦ）活性测定表明重组的融合蛋白具有两因子双重活性。     

人肺癌细胞CPP32基因的克隆及表达

蛋白酶尤其是ＩＣＥ家族的蛋白酶是细胞死亡机制的核心成分．ＩＣＥ蛋白酶家族中,ＣＰＰ３２（又称Ｙａｍａ,ａｐｏｐａｉｎ）在不同形式的凋亡途径中起核心作用．为深入研究ＣＰＰ３２的结构与功能,克隆了ＣＰＰ３２基因,并在大肠杆菌中进行了表达．采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人肺癌细胞株中获得了ＣＰＰ３２蛋白酶基因．ＤＮＡ序列分析表明,该基因由已报道的编码ＣＰＰ３２αｐ２０亚单位和ＣＰＰ３２βｐ１０亚单位的核苷酸组成,提示ＩＣＥ家族蛋白酶寡聚化可能受ＤＮＡ水平调控．将获得的ＣＰＰ３２基因分别重组到ｐＢＶ３２１和ｐＥＸ３１Ｂ载体上,并分别转化到大肠杆菌中,均获得了ＣＰＰ３２基因的较高表达,表达产物主要以包涵体形式存在．     

桑蚕金属硫蛋白基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用\%Bam\%HⅠ和\%Sac\%Ⅰ双酶切质粒pCM1\|1,获得酵母的MTI基因片段,用非放射性地高辛标记作为探针。提取桑蚕肥苏蚕卵的总DNA,分别用\%Eco\%RⅠ、\%Bam\%HⅠ和\%Hin\%dⅢ酶切,与MTI探针进行Southern杂交,出现较强的杂交信号。然后用\%Eco\%RⅠ完全酶切桑吞的总DNA,电洗脱法回收1～6kb的染色体片断,与\%Eco\%RⅠ酶切的M13-载体以3∶1比例连接,转化受体菌DH5α。筛选到4 000多个白色转化子,与探针MTI进行Southern杂交筛选阳性转化子,选择到有强杂交信号的三个转化子［编号为T1(pZHC\|1)\,T5(pZHC\|5)\,T7(pZHC\|7)\]。用12种限制性内切酶对pZHC\|5重组质粒进行酶切分析表明插入片段约12kb,在基因内有一个\%Hin\%dⅢ位点。抗性测定表明受体菌DH5α在含有50mmol/L CuSO\-4的培养基上生长,在含有52mmol/L CuSO\-4的培养基上不生长,而转化子确能在含有52mmol/L CuSO\-4以上的培养基上生长。上述研究结果表明12kb左右的插入片段含有桑吞的金属硫蛋白基因。     

叶绿体分裂相关基因NtFtsZ2-1在大肠杆菌中的表达与定位

FtsZ蛋白在细菌的分裂中担任着重要作用,能够在分裂位点形成一个环状结构而控制细菌的分裂过程。胞内FtsZ蛋白浓度的明显降低或异常升高均可阻断正常的细胞分裂过程进而导致丝状菌体的产生。我们为了研究烟草FtsZ蛋白与大肠杆菌FtsZ蛋白的异同,构建了烟草全长ftsZ2-1与绿色荧光蛋白EGFP的融合表达质粒并转化大肠杆菌JM109。融合表达质粒的过量表达导致宿主菌形成了丝状菌体。通过荧光显微镜观察发现NtFtsZ2-1-EGFP融合蛋白沿着宿主菌体的纵轴方向有规律地聚集成荧光点或荧光带,说明烟草FtsZ2-1蛋白能够识别宿主菌内分裂位点的定位信号并参与其细胞分裂复合物的组装。     

细胞因子人MK基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达(简报)

细胞因子Midkine(简称MK)是新发现的一类肝素结合因子家族中的一员。1988年,Kadamatsu等利用差异杂交法在经维甲酸诱导分化的小鼠畸胎瘤细胞株HM-1中首先克隆到小鼠MK基因。人MK基因则最早是从λgt10人胚肾(20-24周)cDNA库和EMBL-3人胎盘基因组库获得。成熟     

A组轮状病毒SA11VP6基因的克隆和表达

从ＳＡ１１ＶＰ６基因全序列克隆开始,设计一对两端带有酶切位点的引物,逆转录ＰＣＲ扩增出ＶＰ６全基因ＣＤＮＡ。经酶切后插入ＰＵＣ１９,构建了ＶＰ６全基因克隆ＰＲＡ６。再经酶切后插入痘苗病毒载休质凿ＰＪＳＡ１１７５中。利用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＴＫ１４３细胞,利用ＴＫ基因和Ｌａｃ基因作为重组病毒的筛选标记。表达产物用单克隆抗体ＥＬＩＳＡ法检测,发现细胞培养上清和细胞裂解液都是阳性。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂ     

伪狂犬病病毒鄂A株包膜糖蛋白gD基因的克隆与表达

克隆了伪狂犬病病毒鄂A株编码包膜糖蛋白gD的基因并进行了序列测定 ,与国外报道的Rice株相比 ,其核苷酸序列具有 98%的同源性 ,推导氨基酸序列同源性为 97%。将此基因克隆于具有全期启动子盒的杆状病毒转移载体pSX35A中 ,构建成重组转移质粒pSX35A gD ,与致死缺失型线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV OCC- )基因组DNA一起共转染粉纹夜蛾Hi5细胞 ,经同源重组 ,获得含gD基因的重组病毒AcMNPV OCC+ gD。重组病毒经空斑纯化后感染Hi5细胞进行表达分析 ,细胞裂解物的SDS PAGE及Western Blot ting均显示分子量约 47kD的gD蛋白得到了特异性表达 ,其表达量占细胞总蛋白的 6 2 % ,表达的gD蛋白具有免疫原性。     

肿瘤坏死因子相关凋亡受体(TRAIL)cDNA的克隆及高效表达

为了得到人TRAILcDNA并克隆到pGEM-Tvector。利用PCR技术获得目的基因片段 ,通过原核表载体pBV220构建人TRAIL表达质粒。将所得表达质粒转化宿主菌DH5α ,培养至OD60 0 值到达 0 6时 42℃诱导表达 ,并通过SDS PAGE分析表达结果。经凝胶薄层扫描 ,对pBV TRAILD DH5α工程菌热诱导 5h ,TRAIL衍生物蛋白的表达量最高约占菌体可溶性总蛋白的 31 %。人TRAIL基因 ,通过pBV2 2 0原核表达载体可在大肠杆菌中获得高效表达。     

鳜碱性肌球蛋白轻链基因cDNA的克隆及其发育表达分析

肌球蛋白轻链是构成鱼类肌纤维主要组成部分,在鱼类肌肉生长和收缩过程中具有重要作用。鳜鱼具有生长快、肉质细嫩、味道鲜美、营养成分高等优良的性状。研究通过构建鳜肌肉组织cDNA文库分离到两个碱性肌球蛋白轻链基因,即MLC1和MLC3基因。序列分析显示MLC1和MLC3基因cDNA序列全长分别为1237bp和1070bp,分别编码192和150个氨基酸,除去MLC1N端多出的42个氨基酸残基,MLC1与MLC3氨基酸序列同源性为80.3%。通过PROSITEtools软件预测显示两种轻链都具有两个保守的EF-手相结构,其中第二个EF-hand结构除前三个氨基酸外同源性达100%。鱼类MLC3轻链N端没有高等脊椎动物MLC3特有标志序列。采用实时荧光定量PCR方法对鳜鱼MLC1和MLC3发育性表达分析表明,在原肠期开始有低量表达,与原肠期、尾芽期和肌肉效应期相比,心搏期和仔鱼期MLC1和MLC3表达量显著升高。研究结果首次提供了鳜肌肉组织肌球蛋白主要结构基因的分子生物学信息以及它们在鳜肌肉组织发生和功能的相关性。       

人柠檬酸合成酶cDNA的克隆及其表达谱分析

在动物、植物、微生物细胞中普遍存在的三羧酸循环(TCA循环)是产生ATP的主要途径,它不仅参与糖的分解代谢,也参与蛋白质和脂肪的分解代谢。柠檬酸合成酶在TCA循环中起着关键的调节作用,它通过催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合成柠檬酸。本文用基因组信息学方法获得的一个长1636bp的EST重叠群序列,它与猪柠檬酸合成酶cDNA序列高度同源。从这一序列出发,又用PCR方法从人的睾丸组织和骨胳肌组织的cDNA分子库中,分别克隆到一个1492bp的cDNA片段,在其序列中含有一个长1401bp的可读框,该可读框推导的编码蛋白由466个氨基酸组成,它与猪柠檬酸合成酶、鸡柠檬酸合成酶及酵母柠檬酸合成酶的同源度分别达95．9％,92％和60．9％,故认为该cDNA序列可能就是来自人类柠檬酸合成酶基因的转录本。Northern分析表明人类柠檬酸合成酶在心脏和骨胳肌中呈高表达,在脑、肾和胰腺组织中度表达,在小肠和胸腺中未能检出表达,而在其他9种被检测的组织中仅有低表达。     

猴Fertilinβ氨基端93肽基因的克隆及其在大肠杆菌中表达

Fertilin是一种异二聚体精子表面蛋白.业已证明,它在精卵反应中起着重要作用.成熟的Fertilinβ亚基的氨基端93肽含有与整联蛋白结合的整联蛋白配体区.该整联蛋白配体区与蛇毒整联蛋白配体区高度同源,它们能与细胞表面的整联蛋白相结合.在此我们报道猴成熟Fertilinβ氨基端93肽基因的克隆和在大肠杆菌中的表达.用RT-PCR方法获得mmFβNTP93基因,克隆入表达载体pT7-7/hCGβ的EcoRI和BamHI位点,该基因与hCGβ基因一起表达融合蛋白mFβNTP93-hCGβ,Western blotting结果显示,融合蛋白的表观分子量为33kDa,能与抗hCG抗体专一性结合.由于mFβNTP93基因与hCGβ基因相连,因此我们推测,mFβNTP93基因已获得表达.     

三角帆蚌热休克蛋白70基因克隆及其表达分析

对三角帆蚌HSP70基因序列进行全长克隆及其分子生物学分析,并检测其在不同水温刺激下鳃组织中的表达变化。通过高通量转录组测序获得三角帆蚌HSP70基因（HcHSP70）长片段,采用3'RACE对其进行了3'末端克隆,经拼接得到HcHSP70 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对HcHSP70 cDNA全长序列进行了特征分析,采用实时荧光定量PCR技术检测了其组织分布,并结合Western-blot技术检测蚌鳃中该基因mRNA与蛋白经不同水温刺激后的表达变化。结果显示,HcHSP70 cDNA全长为2298 bp,其中开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸。预测分子量大小为71.6 Ku,pH7.0时的理论等电点为5.61。氨基酸序列分析表明,HcHSP70氨基酸序列含HSP70家族的3个标签序列（I₉DLGTTYS₁₆、I₁₉₇FDLGGGTFDVSIL₂₁₀和I₃₃₆ VLVGGSTRIPKVQK₃₅₀）,与长牡蛎及泥蚶的HSP70同源性最高（91%）。实时荧光定量PCR检测结果显示,HcHSP70在鳃、性腺、肝胰腺、外套膜及肌肉等5种被检组织中均有表达,以肝胰腺中的表达水平最高。实时荧光定量PCR与Western-blot技术检测皆表明,蚌鳃组织中HcHSP70基因与蛋白的表达量在37℃时达到最高,而在40℃水温刺激下表达水平下调至正常值,表明其在适应高温刺激时发挥了重要作用。