扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达

【目的】克隆扩展青霉脂肪酶基因,实现具强催化活性的脂肪酶的异源高效表达。【方法】利用RT-PCR扩增扩展青霉CICC 40356脂肪酶(PEL)cDNA序列,利用重叠延伸PCR(Over-lap extension PCR)技术对PEL的10个稀有氨基酸密码子和表达载体pPIC9Kα信号肽的9个氨基酸密码子进行了优化,获得了改造过的脂肪酶基因PELM和表达载体pPIC9KM。并构建了带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL1、pPIC9KM-PELM1、pPIC3.5K-PEL1、pPIC3.5K-PELM1和不带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL2、pPIC9KM-PELM2六个重组质粒。利用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测工程菌脂肪酶的酶活。在此基础上,对工程菌的酶学性质进行了研究。【结果】扩展青霉脂肪酶基因cDNA序列分析结果表明该序列与已报道PEL cDNA序列仅相差3个碱基,同源性高达99%。6个重组工程菌在甲醇诱导下,均表现出pNPP水解活性,28℃诱导100h时酶活达到最高,发酵上清的酶活分别为3.65 U/mL、30.49 U/mL、90.85 U/mL、212.05 U/mL、15.29 U/mL、76.32 U/mL。SDS-PAGE结果表明重组脂肪酶分子量均约28 kDa。酶学性质研究表明,重组脂肪酶PELM最适温度为35℃,最适pH为9.5,在pH7.0-10.0范围内该脂肪酶均较稳定,Ca2+和Mg2+对其有激活作用,Fe2+、Zn2+、Cu2+则有抑制作用,EDTA能使之快速失活。以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其对中链酯(C8-C12)有较强的水解能力,最适底物为为C8的pNP酯。【结论】密码子优化后的扩展青霉脂肪酶基因在毕赤酵母中获得理想的表达,其酶活力比未优化的野生脂肪酶的提高了2.3-2.5倍,表明定点突变对其基因本身更改特有稀有密码子是实现PEL功能蛋白的异源高效表达的有效策略之一。     

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达

【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G+C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。     

解脂耶氏酵母脂肪酶基因lip1的克隆、密码子优化及功能表达

摘要：【目的】克隆解脂耶氏酵母（Yarrawia lipolytica）脂肪酶基因lip1,并通过密码子优化,首次实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的诱导型和组成型表达。【方法】通过PCR扩增Y. lipolytica脂肪酶基因lip1,根据P. pastoris密码子偏爱性,运用重叠延伸PCR合成改造后基因MLip1,将其分别克隆至诱导型分泌载体pPIC9K和新构建的组成型分泌载体pGAP9K上,电转至P. pastoris GS115中,G418抗性筛选得到高拷贝转化重组子,摇瓶发酵     

特异腐质霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

【目的】在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究。【方法】利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ)的cDNA。将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115。【结果】SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达。重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70°C,且在65°C以下具有较好的热稳定性。最适反应pH为6.5,在pH 6.0?7.0之间有较好的稳定性。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础。     

毕赤酵母组成型表达脂肪酶及其高通量筛选方法

【目的】获得组成型表达脂肪酶毕赤酵母,建立利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因的有效方法。【方法】运用PCR技术从pGAPZαA表达载体上扩增得到GAP启动子片段,插入到表达载体pPIC9K-proRCL中,构建组成型表达载体pGAPK-proRCL。在保留含有同源双交换重组序列的诱导型启动子AOX1序列的基础上,电转化后华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶基因proRCL表达盒在毕赤酵母基因组上发生双交换整合事件,从而组成型表达单拷贝的华根霉脂肪酶基因。【结果】重组菌发酵144 h后,脂肪酶最高酶活为130 U/mL。利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因。【结论】该方法将初筛时间从12 d缩短为3 d,排除了多拷贝突变株的干扰,为后续脂肪酶的定向进化及筛选奠定了基础。     

费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵

【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103%(体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB) 13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24°C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10(pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。     

扩展青霉碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

将编码扩展青霉碱性脂肪酶 (PEL)的cDNA克隆到酵母整合型质粒pPIC3.5K ,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115 ,通过橄榄油 MM平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS PAGE分析、橄榄油检验板鉴定 ,表明扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中获得了高效表达。表达蛋白分泌至培养基中 ,分子量约 2 8kD ,与扩展青霉碱性脂肪酶大小一致 ,占分泌蛋白的 95 %。橄榄油检验板检验表明该表达蛋白可分解橄榄油 ,通过优化该表达菌的发酵条件 ,以橄榄油为底物进行酶活测定 ,其发酵液酶活可达 2 6 0u mL。     

黑曲霉h408阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达

【目的】实现在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)h408阿魏酸酯酶A基因(AnfaeA),并对重组酶特性进行表征。【方法】采用重叠延伸PCR扩增黑曲霉h408的阿魏酸酯酶A基因。将AnfaeA基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,成功构建重组质粒pPIC9K-Anfae,经线性化后电转化P.pastoris GS115,透明圈法筛选活性高的转化子后进行诱导表达。利用紫外吸收法测定温度及pH对重组阿魏酸酯酶活性的影响。【结果】成功从A.niger h408中克隆得到阿魏酸酯酶A的cDNA基因(GenBank:KF911349),并实现了其在P.pastoris GS115中的高效表达。该基因长度为783bp,含有1个开放阅读框架(ORF),编码260个氨基酸,Blast分析显示该基因和GenBank中黑曲霉阿魏酸酯酶序列同源性为99%。翻译的氨基酸序列含有脂酶典型的活性盖子和催化三联体结构。从转化板上获得1株编号为pPIC9K-Anfae5的转化子阿魏酸酯酶活性最高,酶活达24.72 U/mL,比活力为40.84 U/mg,比黑曲霉出发菌株(22.1 mU/mL)提高了1100倍左右。重组阿魏酸酯酶的最适pH为5.0,且在pH 4.0-9.0稳定性较好;最适反应温度50℃,在40-60℃时较稳定。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的高效分泌表达为其在饲料工业和造纸工业等工业化应用提供了前提,也为后续改进酶学特性的定向进化奠定实验基础。     

扩展青霉碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

将编码扩展青霉碱性脂肪酶（PEL）的cDNA克隆到酵母整合型质粒pPIC3.5K,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,通过橄榄油MM平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDSPAGE分析、橄榄油检验板鉴定,表明扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中获得了高效表达。表达蛋白分泌至培养基中,分子量约28kD,与扩展青霉碱性脂肪酶大小一致,占分泌蛋白的95%。橄榄油检验板检验表明该表达蛋白可分解橄榄油,通过优化该表达菌的发酵条件,以橄榄油为底物进行酶活测定,其发酵液酶活可达260 u/mL。     

黑曲霉（Aspergillus niger）F044脂肪酶新型基因lipB的克隆、表达及酶学性质分析

摘要：【目的】本研究拟克隆新型的黑曲霉（Aspergillus niger）脂肪酶（EC 3.1.1.3）基因,实现其在大肠杆菌（Escherichia coli）的高效表达,并对表达产物进行系统的酶学性质分析,为该脂肪酶的工业化生产及应用奠定基础。【方法】通过PCR和RT-PCR克隆脂肪酶基因,并将其开放式阅读框（ORF）克隆入融合表达载体pET28a;表达产物经Ni-agarose纯化后对LipB进行酶学性质分析,并通过圆二色谱进行结构分析。【结果】成功地从A. niger F044中克隆了一个新型的脂肪酶基因lipB,获得了该基因的全基因组序列和cDNA序列（GenBank: FJ536287、FJ536288）,并实现了其在E. coli中的高效表达。LipB分子量约为43.0 kDa,最适底物为pNPC（C8）,酶学动力学常数Km=5.98 mmol/L,最适反应温度为50℃,最适pH为6.0;该酶能在40℃条件下保持稳定,在60℃条件下处理1 h后残余酶活仅为18.8%;该酶对Ca2+敏感,当脂肪酶经2 mmol/L Ca2+处理1 h后,酶活提高了2.6倍。圆二色谱分析表明该酶在Ca2+处理前后具有明显的结构变化。【结论】新型A. niger脂肪酶lipB基因的克隆不仅积累了脂肪酶基因资源,而且为高效基因工程菌的构建及规模化应用奠定基础;对LipB的酶学性质分析表明该酶在食品和油酯化工等领域具有广阔的应用前景。     

少根根霉(Rhizopus arrhizus)脂肪酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从少根根霉中扩增出脂肪酶基因(包括前导序列和成熟肽),并将其连接到酵母分泌表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115。利用抗生素G418从重组阳性克隆中筛选得到高拷贝的转化子。在5 L的发酵罐中,当碳源耗尽后开始流加甲醇诱导脂肪酶的表达,经过96 h培养后发酵液上清液中重组脂肪酶(rRAL)的表达量约为90 mg/L。rRAL经过超滤,SP-Sepharose离子交换层析和Butyl-Sepharose疏水层析纯化。纯化后的蛋白在SDS-PAGE上为单一条带,表观分子量为32 kDa,比酶活为1 543 U/mg。N-端序列分析表明rRAL是经过加工后的产物。同时没有发现全长的Rhizopus arrhizus脂肪酶(RAL)被分泌表达。     

白地霉Y162脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

借助生物信息学,对已克隆的地霉属脂肪酶全长基因序列进行同源比对,根据保守序列设计引物,在基因组DNA和cDNA水平上,于国内首次克隆了Geotrichum candidum Y162脂肪酶基因.Gcandidum Y162脂肪酶基因全长1692bp,不含内含子,编码包括19个氨基酸信号肽在内的563个氨基酸.与NCBI GenBank中已报道的地霉属脂肪酶氨基酸序列有86%的一致性.将该基因克隆到pPIC9K表达载体上,转化毕赤酵母GS115,摇瓶发酵96h后毕赤酵母分泌表达55 U/mL重组脂肪酶,实现了脂肪酶的高效表达.酶学性质研究表明,该重组脂肪酶对C9位顺式双键的甘油酯具有明显的底物特异性;对甲醇、甘油等有机溶剂呈现耐受性;最适温度和最适pH分别为50℃和8.0,在pH6.0～10.0及60℃以下能保持60%以上的酶活力.底物特异性、有机溶剂、温度及pH耐受性赋予该重组酶良好工业应用潜力.     

Expression of a mammalian alpha 2,6-sialyltransferase gene in Pichia pastoris

Terminal sialic acid on oligosaccharides of glycoproteins shows several biological functions of the glycoproteins. The yeast Pichia pastoris normally does not contain sialic acid on the oligosaccharides of glycoproteins. A sialyltransferase (ST) gene was transfected into P. pastoris to assess the possibility of using yeast cells as a host to produce sialoglycoproteins. The expression vectors pPIC3.5 and pPIC9 were used as carriers. The recombinant P. pastoris harbouring ST-pPIC3.5 and ST-pPIC9 had sialyltransferase activity of 1.1 and 10.2 mU l(-1) respectively. The ability of the recombinant ST-pPIC3.5 and ST-pPIC9 to transfer the fluoresceinyl-NeuAc into the cell glycoproteins was 36.9 and 20.9 pmol mg -1 protein respectively.     

带His-tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在毕赤酵母中的表达及纯化

将去自身信号肽并且N-端带6×His标签的YlLip2基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化GS115获得高效表达脂肪酶His₆-YlLip2的基因工程菌。筛选到的阳性克隆子摇瓶发酵脂肪酶活力最高为400U/ml。对重组毕赤酵母在10 L发酵罐中表达His₆-YlLip2的分批补料发酵工艺进行了初步优化,探讨了培养基、pH、温度对生物量和重组蛋白表达量的影响。结果表明:采用FM22培养基,诱导温度为25℃,pH 5.0,甲醇诱导114 h后His₆-YlLip2的最高酶活力达到3160U/ml。SDS-PAGE分析表明,蛋白的分子量大约为38kDa。重组的His₆-YlLip2经镍柱一步纯化后的纯度达到95.43%,比酶活达到4250U/mg。     

mdlA基因在毕赤酵母中的高效表达及表达产物性质研究

将编码甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)的基因mdlA插入到分泌表达质粒pPIC9K中,通过电激将线性化的重组质粒整合到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,筛选出H is Mut 表型菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,并用PCR方法鉴定。诱导培养后,SDS-PAGE表明MDGL在毕赤酵母中得到有效表达。表达产物在温度40℃,pH7.5具有最高活性,其发酵液酶活可达到325U/mL,以橄榄油为底物时没有检测到活性。表达产物与甘油三酰酯脂肪酶共同作用时产生的脂肪酸量比甘油三酰酯脂肪酶单独作用提高了93.5%。     

Recombinant expression and characterization of the Candida rugosa lip4 lipase in Pichia pastoris: comparison of glycosylation, activity, and stability

Although Candida rugosa utilizes a nonuniversal serine codon (CUG) for leucine, it is possible to express lipase genes (LIP) in heterologous systems. After replacing the 19 CUG codons in LIP4 with serine codons by site-directed mutagenesis, a recombinant LIP4 was functionally overexpressed in Pichia pastoris in this study. This recombinant glycosylated lipase was secreted into the culture medium with a high purity of 100 mg/liter in a culture broth. Purified recombinant LIP4 had a molecular mass of 60 kDa, showing a range similar to that of lipase in a commercial preparation. Since LIP4 has only a glycosylation site at position Asn-351, this position may also be the major glycosylation site in C. rugosa lipases. Although the thermal stability of recombinant LIP4 significantly increased from 52 to 58 degrees C after glycosylation, there were no significant differences in the catalytic properties of recombinant glycosylated lipase from P. pastoris and the unglycosylated one from Escherichia coil. These two recombinant LIP4s showed higher esterase activities toward long-chain ester (C16 and C18) and exhibited higher lipase activities toward unsaturated and long-chain lipids. In addition, LIP4 does not show interfacial activation as compared with LIP1 toward lipid substrates of tributyrin and triolein. These observations demonstrated that LIP4 shows distinguished catalytic activities with LIP1 in spite of their high sequence homology.     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。