钝齿棒杆菌的代谢改造：L-鸟氨酸与L-瓜氨酸合成菌株的构建

【目的】对一株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢工程改造,构建L-鸟氨酸和L-瓜氨酸合成菌株,并考察其发酵生产相应氨基酸的性能。【方法】分别敲除菌株SYPA5-5鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase,OTC)的编码基因argF和精胺琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase,ASS)的编码基因argG,构建能够合成L-鸟氨酸及L-瓜氨酸的重组菌株SYPA5-5△argF和SYPA5-5△argG;考察不同营养条件对上述重组菌株生长和相应氨基酸积累的影响。【结果】添加0.3 g/L L-精氨酸可满足SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累所需,L-鸟氨酸产量可达21.5 g/L;添加L-精氨酸有利于SYPA5-5△argG的生长,但不利于L-瓜氨酸的积累;不添加L-精氨酸时,L-瓜氨酸产量可达15.2 g/L,同时积累6.8 g/L的L-谷氨酸。【结论】分别敲除L-精氨酸生产菌株SYPA5-5的argF及argG基因,可实现L-精氨酸合成途径的中间代谢物L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的积累,拓展了该菌株的工业应用范围。     

钝齿棒杆菌GlnK在氮代谢调控及L-精氨酸合成中的功能

【目的】钝齿棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株,本研究针对氮代谢PⅡ信号转导蛋白GlnK展开相关功能研究,分析其在钝齿棒杆菌氮代谢调控及L-精氨酸合成中的作用。【方法】以GlnK蛋白为研究对象,通过基因敲除等遗传方法获得过表达、敲除及敲弱glnK的重组钝齿棒杆菌,研究GlnK对NH_4~+吸收的影响,通过RT-qPCR和酶活测定,从转录水平和蛋白水平上揭示GlnK对氮代谢和L-精氨酸合成相关基因表达水平及酶活的影响,通过5-L发酵罐发酵产L-精氨酸研究GlnK对L-精氨酸合成的影响。【结果】过表达glnK能明显促进NH_4~+的吸收,而敲除glnK后则会抑制NH_4~+的摄取;RT-qPCR和酶活测定发现,相比于野生型菌株Cc5-5,glnK过表达菌株Cc-glnK中与铵吸收相关的基因,表达量平均上调约4.58倍,L-精氨酸合成基因簇中基因的表达水平平均上调1.50倍。Cc-glnK中氮代谢相关蛋白的酶活平均提高46.97%;L-精氨酸合成途径上7个关键酶的酶活平均提高30.00%;5-L发酵罐发酵各重组菌株结果表明,Cc-glnK菌株的产量可达49.53 g/L,产率为0.516 g/(L·h),相比于出发菌株Cc5-5,其L-精氨酸产量提高了28.65%。【结论】过表达GlnK能促进NH_4~+的吸收及利用,并通过影响L-精氨酸合成途径上关键基因的表达水平,提高关键酶的酶活,最终提高L-精氨酸的产量。本研究为后续探索钝齿棒杆菌氮代谢调控机制及代谢工程改造钝齿棒杆菌生产L-精氨酸提供了一种新的策略。     

离子转运蛋白调控钝齿棒杆菌离子和pH稳态促进L-精氨酸合成

L-精氨酸是一种半必需氨基酸,广泛应用于食品、制药、饲料等行业。【目的】当前对L-精氨酸生产菌株的研究,极少涉及离子转运领域。在本研究中,发现在发酵时适量添加外源K~+有利于促进钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5合成L-精氨酸。【方法】在C. crenatum SYPA5-5发酵培养基外源添加0.5 g/L和2.5 g/L的K_3PO_4,取对数期发酵样品进行转录组数据分析,挖掘出K~+转运相关的阳离子转运ATP酶CTAP1以及单价阳离子/H~+逆转运蛋白Mrp1A,研究其在C. crenatum SYPA5-5快速合成L-精氨酸阶段,对菌株生长及L-精氨酸合成的影响。【结果】对基因ctap1和mrp1分别进行敲除和过表达,深入研究突变株对L-精氨酸合成的影响。研究发现同时过表达离子转运蛋白CTAP1和Mrp1A更有利于胞内离子、pH稳态和渗透压调节,最终提高L-精氨酸的产量。在补料分批发酵中分别过表达Mrp1A、CTAP1以及同时过表达Mrp1A和CTAP1的菌株L-精氨酸产量分别达到61.4 g/L、63.9 g/L和65.3 g/L,产率分别为0.383 g/g、0.392 g/g和0.395 g/g,比C. crenatum SYPA5-5分别提高了34.9%、38.0%和39.1%。【结论】CTAP1是特异性的K~+转运ATP酶,可以将培养基中的K~+运输到胞内。同时Mrp1A可将胞内K~+和Na~+等单价阳离子运输到胞外,将胞外H~+运输至胞内,中和胞内L-精氨酸所导致的碱性环境,从而维持胞内pH稳定。CTAP1和Mrp1A的研究为解析离子转运机制和L-精氨酸合成之间的联系奠定了基础。     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的敲除对北京棒杆菌PD-67的生理代谢的影响

【目的】为了优化L-色氨酸合成的前体供应,构建北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EC:4.1.1.31,phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPCx)基因ppc敲除的菌株,并研究ppc基因敲除对菌株生理特性的影响。【方法】运用PCR技术扩增ppc基因的上游和下游序列,构建带有目标基因内部缺失的基因整合载体。通过同源重组技术将C.pekinense PD-67的ppc基因敲除,构建ppc基因缺陷突变株C.pekinense PD-67-Δppc。通过摇瓶发酵研究突变株的生理特性,并测定突变株丙酮酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性。【结果】PCR验证和PEPCx活性分析结果表明,筛选到ppc缺陷的突变株。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,突变株的生长速率下降,生物量降低20%,L-色氨酸积累降低62%,丙酮酸激酶活力提高,而丙酮酸羧化酶活力下降。【结论】C.pekinense PD-67的ppc基因敲除以后,对菌株的代谢影响较大。仅通过阻断PEPCx催化的回补途径,减少磷酸烯醇式丙酮酸的分支代谢,不能提高该菌株L-色氨酸的积累。     

谷氨酸代谢调控及hemA过表达促进大肠杆菌血红素合成

【背景】大肠杆菌(Escherichia coli)以谷氨酸为前体经C5途径合成有限的血红素。【目的】探究胞内谷氨酸代谢及谷氨酰-tRNA还原酶基因(hem A)过表达对5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic Acid,ALA)和血红素合成的影响。【方法】通过Red同源重组敲除与谷氨酸代谢有关的mscS与aroG,构建hemA表达载体并导入基因缺失菌株中。【结果】mscS单敲除或mscS与aroG双敲除对菌体生长无显著影响。与出发菌株相比,单敲除与双敲除菌株的谷氨酸含量均有所增加,ALA含量略微下降,血红素含量分别增加了11.6%和35.7%。在双敲除菌株中进一步过表达hemA后,胞内血红素含量增至47.603μmol/L。【结论】通过调控谷氨酸代谢流量与过表达hemA可促进血红素的合成,该结果为增强C5途径的血红素合成提供了新的思路。     

proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响

为了选育精氨酸高产菌株,基于谷氨酸棒杆菌的基因组尺度代谢网络模型的指导,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过基因敲除技术构建了pro C和put P敲除菌株。摇瓶发酵结果表明,pro C敲除菌株精氨酸产量达到9.94g/L,较出发菌株提高了15.90%,葡萄糖转化率提高了26.02%。由于其生长受到明显抑制,因此在发酵液中外源添加24mmol/L的脯氨酸,结果发现其精氨酸产量达到12.22g/L,且菌株恢复生长。put P敲除菌株精氨酸产量达到12.23g/L,较出发菌株提高了42.70%,葡萄糖转化率提高了49.31%。以上结果显示,put P的敲除比pro C的敲除更有利于精氨酸的合成,put P的敲除对菌株的生理代谢基本无影响且无需外添加脯氨酸。     

温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨

【目的】L-丙氨酸的存在导致Escherichia coli的生长速率显著降低,最终会降低发酵过程中L-丙氨酸的体积合成速率。用温度调节基因开关(λpR-pL)高效、动态调控重组E. coli菌株菌体生长与L-丙氨酸合成过程,使两者相协调。【方法】以野生型E. coli B0016为出发菌株,敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径以及丙氨酸消旋酶编码基因(ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA、dadX),获得菌株B0016-060B。将嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的L-丙氨酸脱氢酶基因(alaD)克隆于pL启动子下游,并在B0016-060B菌株中表达,获得菌株B0016-060B/pPL-alaD,进行摇瓶和发酵罐发酵考察菌体生长和L-丙氨酸发酵性能。【结果】竞争代谢途径的敲除显著降低了副产物合成量,仅形成极少量的乙酸、琥珀酸和乙醇。28 °C下菌株B0016-060B/pPL-alaD几乎不合成L-丙氨酸,可保证菌体快速生长;而在42 °C下可高效合成L-丙氨酸。经发酵罐发酵,可合成67.2 g/L L-丙氨酸,体积生产强度达到2.06 g/(L·h)。【结论】通过发酵培养温度的简单切换,分阶段实现了细胞的快速增量和L-丙氨酸的高强度合成。     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的敲除对于谷氨酸棒杆菌V1生理代谢的影响

【目的】L-缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸。为了增加磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的代谢流向,优化L-缬氨酸前体物质的供应,以一株积累L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌V1(Corynebacterium glutamicum V1)为对象,构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因敲除的重组菌株C.glutamicum V1-Δpepc,并研究pepc敲除后菌株生理特性的改变。【方法】运用交叉PCR方法得到pepc基因内部缺失的同源片段Δpepc,并构建敲除质粒pK18mobsacB-Δpepc。利用同源重组技术获得pepc基因缺陷突变株C.glutamicum V1-Δpepc。采用摇瓶发酵对C.glutamicum V1-Δpepc进行发酵特性的研究。对谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamicum ATCC 13032、出发菌株C.glutamicum V1和敲除菌株C.glu-tamicum V1-Δpepc的丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)、丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydro-genase,PDH)、丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase,PC)分别进行测定和分析。【结果】PCR验证以及PEPC酶活测定都表明筛选到pepc缺陷的突变菌株C.glutamicum V1-Δpepc,摇瓶发酵结果表明,突变菌株C.glutamicum V1-Δpepc不再积累L-缬氨酸而是积累L-精氨酸达到7.48 g/L。酶活测定结果表明出发菌株的PDH和PC酶活均低于模式菌株C.glu-tamicum ATCC13032和重组菌株C.glutamicum V1-Δpepc,出发菌株的PK与PEPC酶活与模式菌株没有较大的差异。【结论】研究表明,通过切断PEPC参与的三羧酸循环的回补途径,增加磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的流向使丙酮酸向TCA循环的流量增加,精氨酸的累积量提高。同时,以丙酮酸为前体的L-缬氨酸和丙氨酸的积累量降低。     

比较pta及ack敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响

旁支代谢途径的截断有利于目的氨基酸合成途径的集流。基于基因组尺度代谢网络模型的预测,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过无痕敲除技术分别敲除了编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因及编码乙酸激酶的ack基因,阻断了乙酸的合成。摇瓶发酵结果表明,pta缺失菌株精氨酸产量较出发菌株提高了25.60%,达15.46g/L。葡萄糖转化率提高了29.41%;ack缺失菌株精氨酸产量达13.82g/L,较出发菌株提高了12.81%,葡萄糖转化率提高了26.02%。同时,pta及ack敲除菌株的细胞生长较出发菌株均分别提高了9.19%及7.71%。因此,pta、ack的敲除不仅有利于精氨酸的合成,而且对菌体生长具有促进作用;但pta的敲除更有利于精氨酸的积累。     

以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸整合型重组钝齿棒杆菌的构建

[目的]为了构建一株直接利用廉价的葡萄糖合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌,将来自于植物乳杆菌γ-氨基丁酸合成途径的关键酶谷氨酸脱羧酶基因(lpgad)在产谷氨酸菌株钝齿棒杆菌中进行整合表达,实现葡萄糖到GABA的一步法生产.[方法]运用PCR技术扩增得到带有tac启动子的谷氨酸脱羧酶基因tacgad.通过重叠PCR的方法获得钝齿棒杆菌精氨酸合成途径关键酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)基因内部缺失型基因△argB.利用自杀载体pK18mobsacB构建同源整合载体pK18-△argB::tacgad,以△argB的上下游序列为同源臂,通过两次同源重组将tacgad基因整合到钝齿棒杆菌基因组,同时将NAGK基因argB灭活,利用蔗糖致死基因sacB反向筛选标记筛选得到谷氨酸脱羧酶的重组钝齿棒杆菌C.crenatum △argB::tacgad.重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物进行发酵,测定GABA含量.[结果]重组菌C.crenatum △argB::tacgad成功表达谷氨酸脱羧酶,同时阻断了精氨酸合成途径对谷氨酸到GABA代谢途径的竞争,粗酶液基本检测不到NAGK活性,发酵液无精氨酸合成.通过96 h发酵,重组菌可积累约8.28 g/L的GABA.[结论]本研究通过将谷氨酸脱羧酶基因定向整合到钝齿棒杆菌精氨酸合成途径的关键酶基因argB内部,成功表达谷氨酸脱羧酶的同时阻断竞争途径精氨酸的合成.本研究为实现直接利用葡萄糖合成GABA的一步法生产奠定了基础.     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.