马铃薯遗传转化体系的优化及玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的导入

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系。通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株。经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达。     

Optimization of genetic transformation system of potato and introduction of maize starch branching enzyme gene SBEⅡb into potatoFAN

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系.通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株.经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达.     

马铃薯卷叶病毒基因间隔区转化的马铃薯抗病性研究

将本室合成、克隆的马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll Virus, PLRV)中国分离株的基因间隔区(intergenic sequence, IS)双链cDNA以正、反向两种方式分别构建于转化载体pROK2中,通过致瘤农杆菌介导,以马铃薯叶圆片为转化材料,转化马铃薯栽培品种Desiree,获得了转基因植株.卡那霉素抗性分析和PCR检测目的基因,证明PLRV IS双链cDNA已经整合到转基因马铃薯的染色体基因组中.将转基因植株移栽网棚用蚜虫接种PLRV,观察症状并用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测转基因植株中PLRV含量.结果表明,表达PLRV IS正意和反意RNA的转基因植株,接种病毒后表现无症状或症状轻微,PLRV平均滴度均较未转基因对照植株低.表达正意RNA的转基因植株PLRV滴度降低43%～72%,表达反意RNA的转基因植株PLRV滴度降低72%～86%,由此可见,表达PLRV IS反意RNA的转基因马铃薯对PLRV抗性较强.     

野生天麻DNA导入马铃薯实现遗传转化的研究

采用浸苗法将野生天麻总DNA导入马铃薯试管苗,对筛选得到的转化植株进行蛋白及药用成份的分析。结果显示:(1)在200株转化的马铃薯中有21株的紫外扫描图谱与正常对照组有显著差异,且在220nm有明显吸收峰。(2)5株经PCR扩增出野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因。(3)转基因马铃薯与正常马铃薯的蛋白表达有明显差异,并且在转基因马铃薯中有一条与野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)相同的条带。而正常马铃薯中无此条带。(4)通过薄层层析法检测出3株转基因马铃薯表达野生天麻的有效药用成份天麻素。说明采用浸苗法进行外源总DNA导入是可行的。     

利用RNA干涉技术及微束激光转化法培育抗病毒马铃薯

针对马铃薯生产中危害严重、分布广泛并且具有强烈协生作用的马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒,开展了抗病毒病的育种研究。采用RT-PCR技术分别克隆了267 bp的编码马铃薯X病毒外壳蛋白(PVX-cp)基因的相对保守区段X和294 bp的编码马铃薯Y病毒外壳蛋白(PVY-cp)基因的相对保守区段Y两个片段,将其按顺序连接,形成融合基因XY,然后分别将融合基因XY正向和反向插入到载体pHANN IBAL中,得到了载体pH IV,再用NoⅠt对pH IV进行酶切,将产生的大片段插入到载体pART27中,得到同时以PVX-cp基因和PVY-cp基因为靶标的XY的RNA i载体pAR IV。采用微束激光穿刺转化技术转化马铃薯品种Favorita的愈伤组织,得到了14株表型正常的转基因植株,转基因植株的southern b lot分析表明,导入的外源融合基因拷贝数介于2~4之间。攻毒实验表明,其中11株转基因植株对PVX、PVYo以及PVX和PVYo混合侵染均表现免疫,而其它3株的病毒浓度也低于对照。这一结果将为利用RNA i干涉技术开展植物抗多种病毒病的育种提供重要依据,验证了所构建的RNA干涉(RNA interference RNA i)载体具有良好的功能,同时又一次证明微束激光穿刺法是一种有效的遗传转化手段。     

马铃薯卷叶病毒基因间隔区转化的马铃薯抗病性研究

将本室合成、克隆的马铃薯卷叶病毒（ＰｏｔａｔｏＬｅａｆｒｏｌＶｉｒｕｓ,ＰＬＲＶ）中国分离株的基因间隔区（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ,ＩＳ）双链ｃＤＮＡ以正、反向两种方式分别构建于转化载体ｐＲＯＫ２中,通过致瘤农杆菌介导,以马铃薯叶圆片为转化材料,转化马铃薯栽培品种Ｄｅｓｉｒｅ,获得了转基因植株。卡那霉素抗性分析和ＰＣＲ检测目的基因,证明ＰＬＲＶＩＳ双链ｃＤＮＡ已经整合到转基因马铃薯的染色体基因组中。将转基因植株移栽网棚用蚜虫接种ＰＬＲＶ,观察症状并用酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）检测转基因植株中ＰＬＲＶ含量。结果表明,表达ＰＬＲＶＩＳ正意和反意ＲＮＡ的转基因植株,接种病毒后表现无症状或症状轻微,ＰＬＲＶ平均滴度均较未转基因对照植株低。表达正意ＲＮＡ的转基因植株ＰＬＲＶ滴度降低４３％～７２％,表达反意ＲＮＡ的转基因植株ＰＬＲＶ滴度降低７２％～８６％,由此可见,表达ＰＬＲＶＩＳ反意ＲＮＡ的转基因马铃薯对ＰＬＲＶ抗性较强。     

农杆菌介导的转谷氨酰胺合成酶基因小麦的抗除草剂特性研究

 谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS,E.C. 6.3.1.2）是植物氨同化过程中的关键酶,对植物的氮素吸收和代谢起着至关重要的作用。谷氨酰胺合成酶还是除草剂草胺膦(Phosphinothricin　(PPT)或Basta)的靶标酶。前期工作已从我国特有的豌豆(Pisum satium)品种中克隆了细胞质型谷氨酰胺合成酶（GS1）cDNA和叶绿体型谷氨酰胺合成酶（GS2）cDNA。为了验证谷氨酰胺合成酶的功能,构建了同时含有GS1 cDNA和GS2 cDNA的植物表达载体p2GS。以该表达载体通过农杆菌介导法,转化小麦(Triticum aestivum)的未成熟胚愈伤组织,经PPT筛选及分化再生培养,获得了抗PPT的转基因小麦植株41株。PCR和基因组Southern 杂交分析证实了GS1 和GS2基因已经整合到转基因小麦的基因组。用除草剂草胺膦Basta溶液涂抹转p2GS小麦叶片,结果证明GS转基因植株可以抗高达0.3%的 Basta溶液,而对照植株叶片逐渐变黄直至枯死。转基因小麦植株能正常结实。上述实验结果表明：1) GS基因在小麦植株中获得了有效表达,从而赋予小麦植株抗PPT特性;2) GS基因能够作为研究小麦遗传转化的筛选标记基因。     

禽流感病毒血凝素疫苗在转基因马铃薯中的表达

利用转基因马铃薯表达禽流感病毒血凝素疫苗,将含有禽流感病毒血凝素序列的表达载体导入农杆菌,再感染马铃薯的幼茎外植体。转化植株的再生及温室栽培,Western blot分析表明,83％的转化植株在其块茎组织中表达了重组血凝素,表达量占总蛋白量的0．03－0．04％,结果显示用马铃薯生产口服禽流感疫苗是可行的。     

用基因枪法将抗除草剂基因导入小麦栽培品种的研究

利用基因枪法将抗除草剂bar基因导入西南地区的 3个小麦栽培品种 ,共获得 7个转基因植株 ,转化频率在 0 .45 %～ 1 .2 %之间 ,转化周期缩短至 3个月左右。对抗性植株进行PCR和PCR_Southern杂交检测 ,初步确定bar基因已导入小麦基因组。做转基因植株叶片对除草剂PPT的抗性试验 ,有 4株呈抗性 ,3株呈部分抗性 ,表明bar基因已在小麦植株中得到表达。     

用基因枪法将抗除草剂基因导入小麦栽培品种的研究

利用基因枪法将抗除草剂bar基因导入西南地区的3个小麦栽培品种,共获得7个转基因植株,转化频率在0.45%～1.2%之间,转化周期缩短至3个月左右。对抗性植株进行PCR和PCR_Southern 杂交检测,初步确定bar基因已导入小麦基因组。做转基因植株叶片对除草剂PPT的抗性试验,有4株呈抗性,3株呈部分抗性,表明bar基因已在小麦植株中得到表达。     

马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证

马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种"大西洋"为试验材料,采用RT-PCR扩增获得马铃薯STI-LIKE基因全长片段。RT-PCR定量分析表明,该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明STI-LIKE蛋白具有3个TPR结构域,在高等植物中具有高同源性,是一个普遍存在的蛋白质。为验证STI-LIKE蛋白在拟南芥植株发育中功能,分别构建该基因强启动子表达载体(p BI121)和干扰载体(p HANNIBAL和p ART27),转化拟南芥获得了两种载体的拟南芥转基因植株,同时制备STI-LIKE蛋白抗体验证转基因植株蛋白表达。研究结果表明STI-LIKE基因可能参与拟南芥株型发育过程。     

新型玉米种子生产技术表达载体的构建及遗传转化

本研究在GenBank中找到花粉育性恢复基因MS45、花粉致死基因ZmAA1、颜色筛选标记基因DsRed2及其特异性启动子和终止子序列,并在目的基因和植物表达载体pCAMBIA3300设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建表达载体pCAMBIA3300-MS45-DsRed2-ZmAAI,通过农杆菌介导的萌动胚遗传转化法将构建的表达载体转化到优良玉米自交系吉A001中,通过喷洒含5mg/L除草剂筛选得到397株草胺膦抗性植株,用PCR检测得到119株含有目的基因的阳性植株。结果表明,MS45-DsRed2-ZmAAI基因在玉米中得到表达。     

基因标记、转化、表达与检测

821276大肠杆菌户葡枪普酸酶甚因作为鉴定酵母菌株的标记〔英〕/petering,J……了Am.J。Enol.Vitie一1991,42(i)一6一11〔译自DBA,1991,10(18),91一10239二 大肠杆菌介葡糖普酸酶(GUS)uidA基因(分离自质粒pKLG4的HindIH片段)经改造,即在其编码序列上连接酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子和终止子序列,构成pAW220新质粒,用于在酵母中的表达。pAW220在转化酿酒酵母3A时,可整合至第13染色体的ILVZ基因中。筛选抗性除草剂甲基化Sulfometuron(10产g/ml)的转化株。用Southern杂交法筛选转化株中在ILVZ基因内含有GUS者(3 AM)。3 AM培养于1…     

烟草NtNAC1基因的克隆及其在烟草中的抗旱功能分析

NAC转录因子在植物信号转导及非生物损伤过程中起重要作用。本实验从烟草c DNA文库中克隆了NtNAC1基因,c DNA编码区全长861 bp,编码286个氨基酸。进化树分析结果显示,Nt NAC1基因编码的氨基酸序列与马铃薯同源性最高。农杆菌介导的遗传转化获得37株转基因烟草,用20%PEG6000处理转基因和野生型植株7 d。结果显示,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的酶活性都高于野生型,丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量都低于野生型。RT-PCR分析结果显示,Nt NAC1基因以及Nt NAC基因表达高于野生型,脯氨酸合成的2个关键酶吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸-δ-氨基转移酶(δ-OAT)基因表达低于野生型。选取T_0代转基因和野生型种子,对苗期根系进行耐旱性分析。结果发现,在300 mmol·L~(-1)甘露醇胁迫下,转基因根系比野生型长,野生型根系的生长明显受到抑制。这表明转Nt NAC1基因的表达可能提高了植株的抗旱能力。     

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因(ASA2)作为筛选标记基因,并采用氨基酸的类似物5—甲基色氨酸为筛选剂,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高59％～123％。PCR检测转化子1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物(烟草)编码的邻氨基苯甲酸α—亚基能够与另一种植物(大豆)编码该酶的β—亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。对ASA2基因作为一种新的植物转化筛选标记基因的优缺点进行了讨论。     

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸 ,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因 (ASA2 )作为筛选标记基因 ,并采用氨基酸的类似物 5-甲基色氨酸为筛选剂 ,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组 ,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高 5 9%～ 12 3%。PCR检测转化子 1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物 (烟草 )编码的邻氨基苯甲酸α 亚基能够与另一种植物 (大豆 )编码该酶的 β 亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。对ASA2基因作为一种新的植物转化筛选标记基因的优缺点进行了讨论     

PEG介导下香菇的转化

表达载体p301-bG1含有香菇（Lentinus edodes (Berk.)Sing)三磷酸甘油醛脱氢酶启动子驱动下的gus基因和除草剂抗性基因。利用PEG法实现了p301－bG1对香菇原生质体的转化。香菇原生质体与经PEG纯化的质粒DNA混合,用PEG处理后培养于含40ug/mL除草剂的CYM再生平板上,得到了抗除草剂和有GUS活性的转化菌株。虽然这种方法转化效率较低,但不需要昂贵的仪器和限制性内切酶,为蘑菇的分子育种研究提供了一种简便经济的转化方法。     

转PvPGIP2基因小麦的获得与纹枯病抗性鉴定

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种植物防卫蛋白,可阻止一些病原真菌的侵害。本研究克隆出扁豆PvP-GIP2基因编码序列,构建了受玉米泛素(ubiquitin)启动子控制的PvPGIP2基因表达载体pA25-PvPGIP2;采用基因枪法将pA25-PvPGIP2转化小麦推广品种扬麦18幼胚愈伤组织4000块,获得了203株再生植株。PCR检测出阳性植株65株,转化率为1.625%。对转PvPGIP2基因小麦T1～T2植株,进行外源基因的PCR、RT-PCR、荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病抗性鉴定。结果表明,转入的PvPGIP2能够在转基因小麦中遗传、转录与表达;PvPGIP2基因的表达提高了转基因植株对小麦纹枯病的抗性。     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb高效沉默表达载体的构建及转化表达

淀粉分支酶（starch branching enzyme, SBE）是淀粉合成的限速酶。为了进一步研究SBEⅡb沉默对玉米生长及直链淀粉合成的影响,克隆了玉米（Zea mays）淀粉分支酶SBEⅡb基因片段,构建了SBEⅡb的发卡结构表达载体pTFU-SBEⅡb hairpin,用农杆菌介导法将其导入玉米HiⅡ幼胚中,经除草剂筛选获得了194株转化再生植株,其中4株结实,获得转基因种子35粒。T1代植株经PCR及试纸条检测获得3株阳性材料,半定量RT-PCR结果得出SBEⅡb的表达量降低,推断出基因表达水平降低对直链淀粉的合成具有正效应。     

根癌农杆菌介导的CMO基因转化马铃薯的研究

通过根癌农杆菌介导法将强组成型表达启动子CaMV 35S和逆境诱导表达启动子rd29A 驱动的菠菜胆碱单加氧酶(CMO)基因导入马铃薯栽培品种夏波蒂(Shepody)和费乌瑞它( Favorita)中,获得了抗卡那霉素再生植株,对转化植株进行PCR检测初步表明CMO基因已整 合到转基因马铃薯基因组中.并对光照强度对马铃薯试管薯遗传转化的影响进行了研究,结果表明在诱导芽分化的过程中,2 000 lx的光照强度有利于试管薯薄片直接再生出抗性芽.