北京油鸡MSAP毛细管电泳荧光检测技术的建立

采用毛细管电泳荧光检测技术, 对北京油鸡肌肉组织基因组进行甲基化敏感扩增片段多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)检测。通过对基因组DNA用量、预扩产物稀释倍数、选择性引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和电泳内标量等6个主要参数进行分析和优化, 建立了适合北京油鸡基因组DNA甲基化分析的MSAP毛细管电泳荧光检测技术。重复实验表明, 建立的毛细管电泳荧光标记的MSAP检测技术能够自动地、高通量地分析北京油鸡基因组的DNA甲基化状态, 也适用于其他动植物基因组的DNA甲基化研究。     

DNA分析与扩增

922029利用超薄报胶快速定序ONA〔会,英〕/Sm川1,L .M.…了Abstr.pap.Am.Chem.Soc一1991,202 Meet.,Pt.1一ANYL 33〔译自DBA,1992,10(23),91一13304〕 研究了用毛细管电泳提高荧光DNA白动测序仪的定序速度。用毛细管电泳比用常规电泳分离和测定DNA定序反应荧光标记产物的速度快25倍。为了增加多样本平行分析的分辨逮度,发明了一种进行超薄板(50林m)凝胶电泳的装置。这种凝胶电泳的电场高达300V/cm,利用自显影法经25分钟电泳可厕定多达320碱基的序列。设计并制造了一个用于检测多个在上述超薄凝胶上荧光定序的荧光团的检测系统。…     

毛细管电泳在DNA分析中的应用

简要介绍了CE技术原理,综述毛细管电泳在DNA分子微量检测、片段分离、基因突变及高通量DNA分析与测序中的应用和进展。     

大白菜高通量SSR标记鉴定体系的建立和应用

大白菜是重要的蔬菜作物,准确鉴定大白菜品种对于大白菜种质资源管理、新品种测试、种子质量检测等具有重要意义。本研究从已定位到大白菜10个连锁群的205个SSR标记中,筛选出30个在连锁群上分布均匀、PCR扩增稳定、带型简单的标记,用于大白菜品种DNA指纹鉴定。对入选的引物用4种荧光染料进行了标记,利用基于毛细管电泳荧光检测的DNA分析仪对SSR扩增产物进行检测。通过比较分析2种不同型号的3台DNA分析仪的扩增片段检测数据,明确了不同DNA分析仪的检测数据间一般存在明显的系统误差。系统误差的大小取决于引物,一般在1~4 bp之间。使用扩增产物的片段长度对各SSR位点的不同等位变异进行命名。通过使用一组参照品种,消除了不同批次、不同DNA分析仪型号间的系统误差,保证了检测数据的可重复性和可再现性。在此基础上,对184份大白菜品种进行了DNA分子数据采集。     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

950777用荧光标记的双脱曩桉苷酸终止片段对cosmid DNA进行自动定序和作圈[英]/Obermaier,B.…,BioTechniques.一1992,13(1).一46～47[译自DBA;1992,1l(17),92—09538] 本法使用的一种DNA自动定序仪。只用少量COSmid模板DNA来进行引物的平移,此时,按提供的核苷酸序列数据来合成弓I物,用其对较长序列做分段测定。不需标记gI物在一支管子里即可完成测序反应,而在6.5％PA.GE的单泳道中即能将反应产物分开。用酿酒酵母染色体一Ⅱ左端一个33kb区上.以10个不同的寡核苷酸引物进行lO次独立的定序反应,每个泳道的辨析度是280～340个核苷…     

荧光染料R-藻红蛋白标记小鼠抗人CD4单克隆抗体

以R-藻红蛋白(R-PE)标记小鼠抗人CD4单克隆抗体,形成单色或和用其他荧光染料标记的CD系列单抗组成双色、多色的荧光试剂,应用于流式细胞仪检测分析。用异双功能交联试剂SPDP和SMCC分别活化R-PE和CD4单抗,用DTT使经SPDP活化后的R-PE巯基化,再与用SMCC活化的CD4单抗交联。使用NEM终止交联反应,经Sephacryl S-300柱在AKTA FPLC快速液相色谱系统(简称AKTA)监测下分离纯化。结果用R-PE标记的抗CD4单抗,检测正常人外周血淋巴细胞表面CD4抗原的表达,经流式细胞仪(简称FACS)分析表明,R-PE标记的CD4抗体特异性保持完好,荧光强度较高,还可与用FITC标记的其它CD系列单抗配伍成双标或多标试剂。使用SPDP,SMCC异双功能交联试剂和DTT还原剂,成功地偶联了R-藻红蛋白和CD4单克隆抗体,可应用于流式细胞仪检测分析。     

中华绒螯蟹两种微卫星DNA分型方法的应用比较

为对比荧光标记毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳在微卫星等位基因分型上的效果,试验选择6对微卫星引物,对60个中华绒螯蟹个体基因组DNA进行PCR扩增,荧光标记法共检测出等位基因129个,平均每个位点21.5个等位变异,聚丙烯酰胺凝胶电泳共检测出等位基因174个,平均每个位点29个等位变异。对位点Esin67的PCR产物分别进行重复检测,发现荧光标记法的重复率为100%,而聚丙烯酰胺凝电泳法两次结果存在较大差异,证实了荧光标记法检测的可靠性显著高于聚丙烯酰胺凝胶电泳。对两种方法的检测效率和经济成本的分析表明,荧光标记法虽然成本较高,但效率高于聚丙烯酰胺凝胶电泳法。建立单重PCR的多重毛细管电泳技术是提高效率、降低成本的有效途径。     

荧光标记复合PCR扩增微卫星位点的构建与优化

本研究采用毛细管电泳技术,构建并优化了荧光标记复合PCR同时扩增多个微卫星位点。主要过程为：首先根据设计所扩增微卫星位点的期望长度,将9个微卫星位点分成两组,5个位点用FAM（蓝色）标记,4个位点用HEX（绿色）标记;两种荧光类型分组优化,用琼脂糖胶电泳检测。其次,荧光标记的复合PCR扩增8个中华绒螯蟹样品的9个微卫星位点,采用ABI3730xl毛细管电泳检测,以ROX500（红色）为长度标准物,结果经Genemapper3.5软件 分析,检测结果表明毛细管电泳检测荧光标记复合PCR产物不仅精确读取微卫星位点的长度（分辨率高达1bp）,还能区分微卫星位点复制时滑链所引起的“回声斑”;调整各微卫星位点引物比列使所有位点扩增强弱均匀。最后,逐一检测复合PCR基本参数（dNTP浓度、 PCR程序和模版DNA用量）对复合PCR产物的影响,优化PCR。结果表明通过毛细管电泳检测荧光标记复合PCR产物来读取微卫星位点的基因型具有精确性、高效性和稳定性。     

提高DNA序列测定的准确性方案

目前 ,ＤＮＡ测序的核心仪器是使用荧光染料标记的、具有ＣＣＤ光学系统的ＤＮＡ测序仪 ,其工作原理主要包括 :用不同的荧光染料确定Ａ、Ｇ、Ｃ和Ｔ这 4种碱基的延伸反应 ,通过激光的激发 ,每种染料可以发射出不同的电信号 ,测序仪收集这些光波信号后 ,通过计算机数据分析 ,可得到相应的碱基序列。利用这种方法 ,所有 4种染料可在同一凝胶泳道中检测和辨别 ,消除了因泳道之间迁移率的差异所引起的误差 ,增加了测序的精确度 ;同时 ,可以增加在同一块凝胶上所能分析的模板ＤＮＡ数量。毛细管电泳技术的应用可使测序样品的加样自动化 ,且无须用…     

毛细管电泳四色荧光检测法分析茶树SSR标记

将毛细管电泳四色荧光栓测技术应用于茶树SSR标记分析.该方法采用三引物PCR扩增SSR位点,三引物即在5'端加有M13尾巴序列(5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3')的特异正向引物、特异反向引物及带有荧光标记的通用型M13引物:为了运用四色荧光检测系统使通过一次毛细管电泳能同时检测3个以上的SSR位点,采用蓝、绿、黑3种不同颜色的荧光染料分别对3个M13引物进行标记. 应用该方法对42个茶树品种(系)的16个SSR位点进行遗传分析的结果表明:此法具有简便、可靠、低成本及高通量的优点;且随着所分析SSR位点数的增加,降低成本的效果更加显著.采用建立的方法,还筛选获得了11个多态性丰富的可应用于茶树遗传研究的SSR标记.     

液相定点基因测序仪问世

基因测序是基因治疗中必不可少的关键一步,也是基因检测的金标准。一般基因测序主要包括三个步骤:PCR扩增,对待检测的DNA进行复制放量;用诺贝尔奖成果"末端终止法"进行测序反应;对完成反应的基因序列进行毛细管电泳,而后检测DNA中含有的荧光信号,即可获取基因序列的"密码"。这种方法要求被检样品的癌细胞数不得低于40%,否则会出现假阴性。     

小麦蓝矮植原体染色体DNA的分离

[目的]分离小麦蓝矮(WBD)植原体染色体DNA,并建立WBD植原体染色体分离纯化体系.[方法]采用差速离心和脉冲电泳(PFGE)方法富集纯化WBD植原体染色体DNA,并通过PCR和Southern blot进行检测验证,实时荧光定量PCR方法对分离纯化效果进行定量检测.[结果]脉冲电泳凝胶中出现一条大小约为650 kb的条带,经PCR检测和Southern blot分析表明该条带为WBD植原体的染色体DNA.实时荧光定量PCR检测结果表明采用差速离心与脉冲电泳结合的方法可以将WBD植原体基因组的相对拷贝数提高436.5倍.[结论]采用差速离心与脉冲电泳法结合可以有效地从感染WBD长春花中分离到纯的WBD植原体染色体DNA,WBD植原体染色体DNA大小约为650 kb.     

基因工程

9416685,一荧光标记DNA的单泳道化学定序[英]/Ferra—boli,S.…∥Anal.BiochelTl.一1993,214(2).一566～570E译自DBA,1994,13(2),94—00596] 经HindⅢ和EcoRI消化从质粒pBBⅢR获得含有309bp5S基因的片段。纯化的DNA标记用:(i)在dA’I'P存在下用荧光ddGTP对( )链3,末端标记; (ii     

微流控芯片电泳及其法医学应用

在光学性能良好的Brofloat玻璃电泳芯片上,利用自行搭建的共聚焦激光诱导荧光检测系统,通过对芯片管道表面修饰、筛分介质、分离电场强度、进样方式、电泳温度、进样时间等条件的优化,对含15个STR基因座的法医DNA样品进行电泳分离测试实验.通过对芯片电泳条件优化获得了本电泳系统的最佳条件,成功实现8 min内完成DNA样品片段的分离,表明该微流控芯片电泳系统在法医DNA快速分析方面具有良好的应用前景.     

焦磷酸测序技术其在分子生物学领域的应用

焦磷酸测序技术是一项新型DNA测序技术。在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,将引物上每个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的。操作中不需要电泳、样品标记和染色,具有高度的可重复性,并行性和自动化特点,本综述了焦磷酸测序技术的基本原理,测序过程和它在SNPs研究,病原微生物的快速鉴定、病因学分析、法医鉴定等方面应用。     

焦磷酸测序技术及应用

焦磷酸测序（pyrosequencing）技术是一种新的DNA序列分析技术,其特点是操作简便、大通量、自动化,适合大量样本的快速检测,无须进行电泳、DNA序列无须荧光标记等,是一个理想的遗传分析技术平台.文章对焦磷酸测序技术原理及近年来在单核苷酸多态性研究、微生物鉴定分型和DNA甲基化等方面的应用作一简要综述.     

焦测序技术的研究进展

焦测序技术是一种实时DNA测序技术.它在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,将焦磷酸转化为等量的荧光信号,通过荧光信号的高低实时检测待测序列,操作简便,可实现高通量、自动化测定,检测不需要电泳,不需要对样品标记和染色,结果准确可靠重复性好.本文综述了焦测序技术的基本原理、历史及其在测序模板制备技术、反应体系和检测仪器三个方面的最新进展,并重点介绍制备单链的Late-PCR技术、高灵敏度反应体系的获得以及454公司超高通量测序技术,并对焦测序技术的发展做了展望.     

双加氧酶α亚基保守序列克隆及探针制备

制备地高辛标记的环羟基化双加氧酶的α亚基保守序列探针。利用PCR法成功地克隆了环羟基化双加氧酶的α亚基保守序列310 bp片段,并对其进行测序。利用PCR法制备地高辛标记探针,对新标记的探针进行检测,结果显示其标记效率在0.1 pg/μL;敏感性检测表明,对同源DNA的检出限量为100 pg;对提取的副溶血性孤菌质粒DNA、短小芽胞杆菌总DNA杂交均呈阴性,说明该探针具有较强的特异性。     

背角无齿蚌基因组(GT)n微卫星DNA特征

利用磁珠富集法筛选背角无齿蚌(Anodonta woodiana)的微卫星分子标记,采用Sau3A1酶对完整DNA进行酶切,以生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从酶切片段中筛选微卫星序列.洗脱的杂交片段克隆到PGEM-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过菌液PCR筛选检测出阳性克隆进行测序.结果表明:在筛选的18...     

聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染方法

聚丙烯酰胶凝胶电泳具有极高的分辨率,用于DNA分析时,长度仅差0.2％（即对500bp样品中的1bp长度差异）也可以凝胶上分开,因此被广泛用于对DNA需要进行高分辨率分析的程序之中,直到目前为止它仍是DNA测序工作中DNA片段长度检测的主要手段。由于聚丙烯酰胺凝胶对荧光染料溴化乙锭的荧光有熄灭作用,EB染色法很难检测到少于10纳克的DNA条带,因此在传统的DNA测序工作中经常采用放射性同位素自显影方法来检测DNA带的位置,不但增加了实验成本,而且使操作本来就较为繁琐的聚丙烯酸胶凝胶电泳变得更加麻烦;利用荧光标记的方法虽然…