水稻蜡质基因第一内含子碱基突变引起其RNA二级结构的可能变化

通过体外转录得到籼稻品种２３２蜡质基因第一内含于５’端４３０ｂｐ的ｓｓＲＮＡ分子,以及在此区域发生了自然突变的粳稻品种寒丰蜡质基因经一内含子５’端同样长度的ｓｓＲＮＡ分子。部分变性胶电泳结果表明两种ｓｓＲＮＡ分子的迁移速率不同。将两种ｓｓＲＮＡ分子的核酸序列用计算机分析,表明此两种ｓｓＲＮＡ分子能形成不同的茎－环结构,自由能值也有差异。对突变引起的这些不同与两种水稻品种蜡质基因转录本剪接的差异进行     

水稻蜡质基因5‘非翻译区一个与调控有关的内含子

从发育的水稻种子中分离出ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ反应并结合顺序测定,在籼稻２３２蜡质基因编码区５‘上游非翻译区中证明确实存在一个长度为１１２６ｂｐ的内含子,其Ａ＋Ｔ碱基的含量高达６７．４％,它的边界符合真核基因内含子的ＧＴ－ＡＧ规则。表明该内含子与蜡质基因的表达调控有一定的关系。     

水稻蜡质基因5'非翻译区一个与调控有关的内含子

从发育的水稻种子中分离出RNA,经RT－PCR反应并结合顺序测定,在籼稻232蜡质基因编码区5′上游非翻译区中证明确实存在一个长度为1126bp的内含于,其A＋T碱基的含量高达67．4％,它的边界符合真核基因内含子的GT-AG规则。表明该内含子与蜡质基因的表达调控有一定的关系。     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3．1和2．1kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上（1）去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;（2）将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中（3．1kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中,低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换。将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性。结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第1内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常,从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因。     

糯性水稻中蜡质基因第1内含子的剪接活性

以前的研究结果表明 ,非糯性的稻米中直链淀粉的含量与各品种中蜡质基因 (Wx)第 1内含子被剪接的效率有关 ,即剪接效率高的品种直链淀粉含量也高。为弄清糯米中不含直链淀粉是否也与此内含子剪接效率有关系 ,构建了蜡质基因启动子 (来自籼稻品种2 32 )、蜡质基因第 1内含子 [来自籼稻品种 2 32 (高直链淀粉含量的品种 )或粳稻品种寒丰 6 36 6 (中、低直链淀粉含量的品种 ) ]与GUS报告基因组成的两种嵌合基因 ,将含有这两种嵌合基因的质粒分别转化进粳性糯稻品种奉糯 5 93中 ,同时还分别转化进非糯性的籼稻品种特青和粳稻品种中花 11中作为对照 ,测定它们的抗性愈伤组织与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。结果表明与在非糯性的籼稻和粳稻中一样 ,这两种嵌合质粒在不合成直链淀粉的糯稻中也有相当水平的表达。从此结果可以推测 ,糯稻品种有从嵌合基因的转录本中剪接蜡质基因第 1内含子的正常能力 ,而在糯稻中缺乏直链淀粉可能是糯稻蜡质基因第1内含子中的其它突变所造成的     

糯性水稻中蜡质基因第1内含子的剪接活性

以前的研究结果表明,非糯性的稻米中直链淀粉的含量与各品种中蜡质基因（Ｗｘ）第１内含子被剪接的效率有关,即剪接效率高的品种直链淀粉含量也高。为弄清糯米中不含直链淀粉是否也与此内含子剪接效率有关系,构建了蜡质基因启动子,（来自灿稻品种２３２）、蜡质基因第１内含子「来自籼稻品种２３２（高直链淀粉含量的品种）或粳稻品种寒丰６３６６（中、低直链淀粉含量的品种）或粳稻品种寒丰６３６６（中、低直链淀粉含量的品种     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对-基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子1 126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基影响了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3.1和2.1 kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上,(1)去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;(2)将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中(3.1 kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中、低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换.将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性.结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第l内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常、从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因.     

水稻蜡质基因第一内含子中g片段上核蛋白因子结合位点的确定

水稻蜡质基因５’非翻译区中的第一内含子具有增强基因表达的作用,本实验室曾检测到该内含子中的一段１７１ｂｐ长的ｇ的片段与水稻未成熟种子核蛋白存在特异性结合。本文进一步用凝胶滞后实验和足印实验确定了该核蛋白在ｇ片段上的结合位点位于蜡质基因转录起始点下游７８３－８１８ｂｐ处,该结合位点富含ＡＴ碱基;Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ实验测出该蛋白的分子量约为２０ｋＤ。用硫酸铵分步沉淀和肝素－Ｓｅｐｈａｒｏ     

水稻OsBP-73基因表达需要其内含子参与

该实验室以前的研究表明,水稻OsBP-73基因含有2个外显子和1个长度为2 471 bp的内含子.该文报告用OsBP-73基因ATG翻译起始密码子(在第1外显子中)上游序列(1- 818～ 215)与GUS基因构成嵌合质粒pRSSl,将该质粒转化水稻后,在抗性愈伤组织和转基因植株中未能检测到GUS基因的表达.只有用含有完整的内含子及其上游序列(1 818～ 2 844)与GUS基因构成嵌合质粒(p13GNF)时,才能在p13GNF的转基因抗性愈伤组织和植株中检测到GUS基因的表达.实验还证明,单是内含子序列并不能驱动GUS基因在转基因水稻中表达.由此推测:OsBP-73基因的启动子序列驱动基因表达时,需要基因内含子的参与.     

水稻蜡质基因5’端上游顺序中的核蛋白结合区

通过ｗｘ基因转录起始点上游２１２０ｂｐ长的ＤＮＡ序列的测定,用不同的限制性内切酶对此片段进行消化,获得１５个大小不同的ＤＮＡ片段并构建成不同的亚克隆。这些片段经３２Ｐ标记后分别做探针同水稻不同组织来源的核蛋白进行凝胶滞后实验和特异的竞争实验,表明ＨｉｎｆＩａ－２、ＨｉｎｆＩｃ－１、ＨｉｎｆＩｃ－２、ＨｉｎｆＩｄ、ＲｓａＩａ和ＲｓａＩｅ（ＲｓａＩａ片段与ＨｉｎｆＩａ、ＨｉｎｆＩｃ片段重叠）片段能与从未成熟的水稻种子中抽提的核蛋白结合。     

金鱼Vsx1基因结构及其内含子多态性分析

Vsx1是第一个在金鱼中发现的编码含有同源异型框(homeodomain)和CVC结构域蛋白的基因。该基因在胚胎发育的不同阶段在胚胎的不同区域和不同组织中表达,并已经证明它在视网膜视锥双极细胞的分化和正常功能的维持中具有重要作用。为了进一步研究该基因在不同发育阶段组织特异性表达的调节机制,实验用PCR方法分析了金鱼Vsx1的基因组结构和内含子多态性。结果表明:金鱼Vsx1基因由5个外显子和4个内含子组成,与斑马鱼、人、小鼠的Vsx1基因结构相同。4个内含子中,第一内含子有两种序列差异明显的类型,但第二、三、四内含子无明显差异。第一内含子的一种类型比另外一种类型多39个碱基,这39个碱基中包括了真核生物增强子的核心序列。这一观测结果提示金鱼Vsx1第一内含子可能与该基因的发育阶段特异性和组织特异性表达调节有关。同时,第一内含子序列的明显差异也为分析Vsx1不同等位基因或基因拷贝的表达活性,以及组织特异性表达调节方式提供了合适的探针序列。     

水稻蜡质基因5'上游区中31 bp序列增强基因表达的作用

为研究水稻蜡质基因 (Wx) 5’上游区中一个与胚乳核蛋白结合的 31bp序列在基因表达中的作用 ,将一系列包含或不包含此序列的长度不同的Wx启动区与 β 葡萄糖苷酸酶基因 (GUS)编码区连接 ,构建成嵌合质粒。将这些质粒通过农杆菌介导转化水稻幼胚愈伤组织 ,并分化产生转基因植株。分别测定抗性愈伤组织中与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。结果表明含有 31bp序列的比不含此序列的Wx启动区使GUS报告基因的表达水平高出 2～ 3倍     

RNA二级结构数据库

RNA分子众多、结构复杂、功能重要,已经成为当前重要的研究热点之一。RNA的功能与结构密切相关,伴随RNA分子及功能的发现,建立了有关RNA二级结构的数据库,一方面有助于理解RNA功能的结构基础,一方面有助于开发各种有关RNA结构的预测模型。本文对近年常见的RNA二级结构数据库作一概述,希望有助于相关工作者更好地了解与应用相关数据。     

水稻Wx基因表达调控的研究进展

水稻Wx基因编码颗粒结合淀粉合成酶(GBSS),是控制直链淀粉合成的主效基因。文中主要从转录水平和转录后水平介绍水稻Wx基因表达调控的研究进展,同时介绍转基因、遗传背景以及环境温度对Wx基因表达的影响,并提出Wx基因表达调控研究中一些期待解决的问题。     

RNA二级结构预测系统构建

运用下列RNA二级结构预测算法:碱基最大配对方法、Zuker极小化自由能方法、螺旋区最优堆积、螺旋区随机堆积和所有可能组合方法与基于一级螺旋区的RNA二级结构绘图技术, 构建了RNA二级结构预测系统Rnafold. 另外, 通过随机选取20个tRNA序列, 从自由能和三叶草结构两个方面比较了前4种二级结构预测算法, 并运用t检验方法分析了自由能的统计学差别. 从三叶草结构来看, 以随机堆积方法最好, 其次是螺旋区最优堆积方法和Zuker算法, 以碱基最大配对方法最差. 最后, 分析了两种极小化自由能方法之间的差别.