DNase的DNA-PAGE快速分析法

核酸酶,特别是DNase,往往和机体的生理状况及病变有密切的关系,如果能建立一种简便的核酸酶分析方法,将对临床诊断、探讨病变机制及筛选药物都有一定的价值。关于DNase的分析Boyd等先后建立了DNA-聚丙烯酰胺凝胶电泳(DNA-PAGE)法;Brown等又将它加以简化,并将它直接用于细胞抽提液中DNase的鉴定与比较。本文又作了改进,降低了分离胶中的DNA含量,并以溴化乙锭(Ethidium Bromid),代替焦宁Y(Pyronin Y)。结果表明,改进后保温与染色时间可以大大缩短,检测灵敏度提高。应用这种方法检定人和小鼠白细胞和肝细胞中的DNase,表明,不同类型的细胞中包含各自特征的DNase酶谱,而且它对反应条件有不同的要求,对抑制剂有不     

参与细胞凋亡的核酸酶

细胞凋亡是机体内一种重要而且保守的细胞去除机制。染色质的降解是凋亡的重要标志之一,它需要核酸酶的参与。到目前为止,参与凋亡的核酸内切酶可以分为三类:DNaseⅠ家族,DNaseⅡ家族,CAD。不同的细胞在凋亡的时候会激活不同的核酸酶,相同的细胞在不同的诱导方式下也会激活不同的核酸酶,因此,凋亡过程中,那些核酸酶的激活是由细胞种类和诱导方式等特异性所决定的。     

正常及白血病小鼠白细胞染色质和DNA的酶切分析

 本文应用的核酸酶为DNaseⅡ、微球菌核酸酶与限制性内切核酸酶BstNI、EcoRⅡ、HpaⅡ和MspⅠ,将它们作用于正常小鼠615和可移植性白血病小鼠L7712脾脏白细胞染包质及其DNA,根据酶切电泳谱及水解动力学分析表明:1.白血病小鼠染色质相对正常小鼠染色质易被DNaseⅡ微球菌核酸酶水解;2.白血病小鼠染色质比正常小鼠者易被MspⅠ水解,但其DNA的MspⅠ酶切电泳谱无明显差别;3.白血病小鼠染色质及其DNA较正常小鼠染色质及其DNA易被EcoRⅡ水解。这些观察说明,白血病小鼠脾脏白细胞染色质有较活跃的构象状态;其染色质DNA的CCATGC区段内有较低的甲基化程度。     

测定脱氧核糖核酸酶的简单方法——荧光法

脱氧核糖核酸酶 (DNase) 是真核与原核细胞中广泛存在的DNA水解酶。1962年Kurnick曾对某些根据底物特性变化来测定DNase活性的方法作了评述。近年来建立了更灵敏的用同位素测定DNase活性的方法。但由于同位素价格高昂,危险,又受本身半衰期和比强度的限制,有时又需自己标记合成底物,所以在应用上有一定的局限性。本文介绍一种简单、灵敏的测定DNase活性的荧光法。其基本原理是根据DNA和溴化乙锭(EB)结合发生荧光,其强度与DNA量成正比。当EB-DNA复合物经DNase处理后,由于DNA被降解、     

重组旋毛虫plancitoxin-1-like活性位点突变体蛋白的核酸酶活性

旋毛虫plancitoxin-1-like(Ts-Pt)是旋毛虫125种DNaseⅡ家族蛋白中唯一具有典型DNaseⅡ活性区域HKD基序的核酸酶,且普遍认为,组氨酸位点是DNaseⅡ的活性氨基酸位点。为研究Ts-Pt活性位点突变体蛋白的核酸酶活性,利用重叠PCR方法获得Ts-Pt活性位点突变体片段,以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达。重组Ts-Pt突变体蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用琼脂糖凝胶电泳法和核酸酶酶谱分析重组Ts-Pt突变体蛋白的核酸酶活性。成功构建含Ts-Pt突变体重组质粒的基因工程菌,SDS-PAGE和亲和层析纯化结果显示,重组Ts-Pt突变体蛋白呈包涵体表达。重组蛋白经复性后并没有表现出核酸酶活性,但核酸酶酶谱分析结果显示,包涵体表达的重组Ts-Pt突变体蛋白表现出降解DNA的能力。同时,N端和C端活性位点H及HCK和DHSK突变并不影响Ts-Pt的核酸酶活性,研究结果为进一步研究庞大的DNaseⅡ家族蛋白在旋毛虫发育和感染方面的作用提供一定的参考。     

毛竹笋体生长过程中脱氧核糖核酸酶活性的变化

细胞生长与代谢状况的变化密切有关,在细胞从分生期到成熟期的转变过程中,酶活性首先有很大的变化(Robison等1959)。DNase是参与核酸代谢的重要酶类之一,它在体内能降解DNA,但是它也可以参加 DNA的合成(Lehman 1967)。虽然在微生物和动物组织中已经证明 DNase的活性水平与DNA合成和生长速度之间具有正相关(Eley等1966,Shortman等1964),但是在高等植物中这方面的研究很少。竹笋生长极为迅速,而且在笋体生长过程中还会出现退败现象。关于竹笋生长和退败过程中DNase活性的变化尚无报道。为此,我们对竹笋DNase的活性与生长的关系进行了探讨,为阐明竹笋退败的生理原因和拟定防止措施提供参考。     

检测柯萨奇B病毒RNA的原位RT-PCR技术

建立I检测柯萨奇B病毒（CBV）RNA的原位RT—PCR技术（直接法）,并对CBV（1～6型）感染Hds细胞中的病毒RNA进行检测,同时对照检测了经核酸酶（DNase和RNase）处理后的病毒感染Hthe细胞和非感染的Hds细胞。实验结果表明,经原位RT－PCR扩增后,CBV感染的Hem细胞呈蓝黑着色,阳性信号充满细胞;而非病毒感染的Hem细胞不着色;核酸酶消化实验证实,经RNase作用后CBV感染Hem细胞的原位RT－PCR阳性信号消失,DNase和RN＿共同作用时,阳性信号也消失,但DNase作用个影响阳性信号。说明原位RT～PCR的阳性信号是CBV特异性…     

DNA与蛋白质的相互作用及其生物学研究方法

DNA和蛋白质是构成生物体最为重要的两类生物大分子,两者特异性或非特异性识别及相互作用在整个基因组表达调控过程中发挥着重要的作用,是了解生命活动基本过程的分子基础。为此,从DNA与蛋白质相互作用的概述及其作用形式入手,对目前应用较多的几种分子生物学检测方法,如电泳迁移率变动分析(EMSA)、DNase I足迹法(DNase I footprinting)、酵母单杂交技术(Y1H)以及染色质免疫沉淀技术(Ch IP)的原理、优缺点、优化方法及其最新应用等进行了综述。     

脱氧核糖核酸内切酶与细胞凋亡

哺乳动物细胞广泛存在细胞凋亡。脱氧核糖核酸内切酶(DNase)在细胞凋亡中发挥重要作用,染色质DNA降解、浓缩及细胞核结构的破坏都与DNase有关。目前已发现多种DNase参与不同类型细胞的凋亡。本重点对DNaseⅠ、DNaseⅡ、NUC18、NUC70、AN34、DFF(DFF40/DFF45)等内源性DNase与哺乳动物细胞凋亡的关系作系统的归纳和分析。     

棉酚对DNA酶某些性质的影响

DNase用棉酚处理后,经聚丙烯酸胺凝胶平板电泳与对照相比,电泳度无明显差异,均呈单一区带,表明棉酚对DNase所带电荷及分子量无影响。棉酚可改变DNase在225nm和280nm波长处的吸收,对DNase的荧光有粹灭作用,表明棉酚破坏了DNase的空间构象。棉酚与DNase的浓度(W/V)为1:1以上时,酶活性受到显著影响,呈现出反竞争性抑制作用。     

辐射增敏剂甲硝唑氨酸对坪期V_(79)细胞DNase活力的影响

研究了辐射增敏剂甲硝唑氨酸(CM)对受照前后坪期V_(79)细胞DNase活力的影响。结果表明CM在一定浓度范围内(1—10mmol/L)对DNase的激活作用有浓度依赖关系。细胞经6—12Gyγ线照后DNase活力亦增高,若照射合并CM处理后,则对DNase激活有相加作用。还就DNase活力升高与DNA链断裂间的可能关系进行了讨论。     

一种灵敏实用的DNase Ⅰ定量测活方法

DNase I的测活方法有紫外吸收法、同位素法和荧光法等.紫外吸收法简便,但灵敏度较低.同位素法灵敏度高,但实验条件要求高,且操作复杂.荧光法灵敏度较高,也简便,但影响因素较多.我们建立了一种以固定化DNA为底物的微量紫外吸收法,它较简便,灵敏度也较高.材料与方法材料:DNase I (Seravac Laboratories出     

生物工程技术讲座(十) 核酸标记—生物探针法

在核酸的研究中不用放射性同位素,而用生物素(biotin)标记DNA或RNA分子做为探针来检测核酸分子的方法,是最近几年内开展起来的实验新技术。按一般常规在进行核酸的分析、鉴定以及分子杂交等实验之前,首先以所谓“DNA缺口翻译”的方法制备用同位素标记的DNA(探针)。即把待标记的已知DNA分子用核酸酶(DNase)切成缺口,加入能识别并附着在缺口上的大肠杆菌     

新型多价大肠埃希菌噬菌体285P生物学特性研究

筛选多价大肠埃希菌噬菌体,确定其宽噬宿主谱、形态大小及核酸类型等基本特征,为应用于环境微生物消毒奠定基础。应用双层琼脂平板法确定多价噬菌体的宿主谱;透视电镜观察形态结构;提取核酸,并利用分光光度法和核酸酶(DNase、RNase A及S1)酶切的方法对核酸进行鉴定;SDS-PAGE电泳分析噬菌体膜蛋白。大肠埃希菌BL21、DH5α、JM109为噬菌体285P的宽噬宿主;电镜下呈微球型,边缘光滑,短尾,颗粒直径约81 nm;分光光度法及核酸酶切法均证实核酸为双链DNA;膜蛋白略小于43 ku。噬菌体285P对多株大肠埃希菌具有宽噬作用,对环境中微生物的控制具有潜在的应用价值。     

人工核酸酶介导的基因组编辑技术

传统的基因组编辑技术是基于胚胎干细胞和同源重组实现生物基因组定向改造,但是该技术打靶效率低,严重制约了生命科学以及医学的研究.因此,研究新的基因组编辑技术十分重要.人工核酸酶介导的基因组编辑技术是通过特异性识别靶位点造成DNA双链断裂,引起细胞内源性的修复机制实现靶基因的修饰.与传统的基因组编辑技术相比,人工核酸酶技术打靶效率高,这对于基因功能的研究、构建人类疾病动物模型以及探索新型疾病治疗方案有着重要的意义.人工核酸酶技术有3种类型：锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子核酸酶(TALEN)及规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR).本文将对以上3种人工核酸酶技术的原理以及在生命科学和医学研究的应用进行综述.     

E.coli外切核酸酶Ⅲ的提取和纯化

E.coli外切核酸酶Ⅲ(EXOⅢ)有四种功能。第一,从双链DNA 3’端向5’端逐个水解磷酸二酯键,释放出5’-单核苷酸,因此是3’→5’的外切核酸酶。第二,水解DNA的3’末端磷酸单酯键,释放出无机磷酸。第三,它可以在DNA无嘌呤区段上水解磷酸二酯键,因而又是无嘌呤或无嘧啶内切核酸酶。最后,对     

柚子(Citrus grandis Osbeck)S-like核酸酶基因CgSL1的分离与特征分析

从柚子(CitrusgrandisOsbeck)2个自交不亲和品种溪蜜柚和度尾蜜柚的花柱中克隆出一个类似S核酸酶基因CgSL1(C.grandisS-likeRNase),它的cDNA序列全长1074bp,编码297个氨基酸。通过与其它植物S-like核酸酶和S核酸酶氨基酸序列进行比较,发现CgSL1类似于S-like核酸酶,与拟南芥中的RNS2一致性为62.5%。对CgSL1的表达分析表明该基因在花柱、花药、叶片不同器官以及花柱的不同发育阶段均有表达,且在花柱中的表达随衰老增强,由此推测它可能与衰老有关。     

马尾松毛虫蛋白质、核酸酶和羧酸酯酶与耐药性的关系

马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus Walker)幼虫蛋白质含量、羧酸酯酶和多酚氧化酶活力与虫龄大小成正相关;氰戊菊酯处理后,兴奋期的蛋白质含量和羧酸酯酶活力上升,到抑制期均降低到正常虫体的水平,而多酚氧化酶的变动不大。正常虫体中脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)的活力存在差异:DNase从3—5龄幼虫随虫体增大而上升,到6龄时明显降低;RNase与虫龄大小成负相关;氰戊菊酯处理后,DNase便开始下降并低于正常虫体的水平,而RNase在兴奋期上升,到抑制期下降亦低于正常虫体水平。结果说明,除多酚氧化酶外,蛋白质、核酸酶和羧酸酯酶均与耐药性存在一定的相关性,研制酶的抑制剂具有实用意义。根据毒力测定结果,马尾松毛虫幼虫随虫龄增大而耐药力增加,氰戊菊醋对5龄幼虫是3龄的2.8倍,6龄是4龄的2.3倍。因此,掌握在4龄前进行药物防治是合理的。