大肠杆菌中一种对NF—IL63‘UTR专一的结合蛋白

在大肠杆菌ＴＧ１中,发现了一种与人白介素６核转录因子ｍＲＮＡ的３’非翻译区专一结合的蛋白,其Ｎ－端氨基酸序列为Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ｉｌｕ－Ｐｈｅ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓｓ（？）－Ｇｌｙ。对数据库检索未发现完全同源的蛋白。对于在大肠杆菌中发现真核ｍＲＮＡ专一结合蛋白的意义做了讨论。     

噬菌体显示法克隆RNA结合蛋白cDNA——表达文库的构建

试图用噬菌体显示法(phage display)克隆编码与人白细胞介素6核转录因子的3′非翻译区(NF-IL6 3′UTR)特异结合的蛋白的cDNA.构建了回复系RR细胞的cDNA的噬粒(phagemid)表达文库,并设法除去了cDNA的大部分终止密码子.鉴定表明,该文库中含有各种大小的cDNA插入片段,并能够表达外源cDNA,为用噬菌体显示法克隆RNA结合蛋白基因或cDNA做好了准备.     

cDNA克隆p14－6肿瘤抑制功能的分子机制

本文探讨了具有肿瘤抑制功能的ｃＤＮＡ克隆Ｐ１４－６（即人白细胞介素６核转录因子ＮＦ－ＩＬ６的３’非翻译区）的ＲＮＡ转录物与回复相关蛋白ＢＮＦ的相互作用,发现该ＲＮＡ与ＢＮＦ的相互作用位点为其３’侧的富Ｕ序列内的１个２４核苷酸片段;并发现ＢＮＦ系一群蛋白质,它们可能先相互结合成１个蛋白质复合物,然后再与ＲＮＡ位点作用．其中可能只有１个蛋白质（Ｒ６２）直接与该ＲＮＡ结合。     

人肠道病毒D68型5′UTR间隔区域对下游基因表达的影响

【背景】人肠道病毒D68型(EV-D68)属于小RNA病毒科肠道病毒属人肠道病毒D组,在2014年8月至2015年1月间,该病毒引起的感染在北美显著增多,我国也出现流行。相对于原始的Fermon毒株,流行株5′UTR区域几乎都存在一两处缺失,在起始密码子ATG前还存在两处ataaca重复序列,这两处位点的功能尚未见报道。【目的】探讨流行株5′UTR区域的缺失对下游基因表达的影响,以及ataaca重复序列的功能。【方法】通过序列比对分析现阶段流行株与原始毒株Fermon株5′UTR的差异以及保守区域,利用分子生物学方法缺失上述区域后,利用双荧光素酶报告系统分析5′UTR中上述区域对下游报告基因的影响。【结果】序列比对分析发现,目前流行的EV-D68毒株在对应于Fermon株基因组5′UTR的685-707区域发生了23个碱基的缺失,而部分毒株还在718-729区域发生了第二处缺失。荧光素酶结果显示,仅第一处缺失可以极大地提高下游基因的表达量,同时具有两处缺失则与野生型几乎相当,而仅缺失第二段序列则降低了下游基因的表达量。此外,还发现第一处缺失中的序列可能对下游基因表达起到了抑制作用,而靠...     

一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法

用马铃薯淀粉柱可以直接分离麦芽糖结合蛋白-乳酸脱氢酶辅酶结合结构域融合蛋白,并得到满意的结果.它提纯的程度和吸附量都和商品交联直链淀粉亲和层析柱相比拟,但是成本却要低很多,而且从市场上买来的马铃薯淀粉就可以应用.它可以成为大规模生产的一种工艺路线.     

动植物中RNA结合蛋白的研究进展

RNA结合蛋白(RNA-binding proteins)在转录后基因表达调节中起着重要的作用,它通过和RNA相互作用来调节细胞的功能。RNA结合蛋白参与RNA剪接、多聚腺苷化作用、序列编辑、RNA转运、维持RNA的稳定和降解、细胞内定位和翻译控制等RNA代谢的各个方面。主要介绍了RNA结合蛋白的结构、靶标RNA及RNA结合蛋白在动植物和疾病中的研究。     

A/U富集片段RNA结合蛋白的固相纯化与鉴定

RNA与细胞靶蛋白结合是RNA发挥其生物学功能的重要基础,因此,分离和鉴定RNA结合蛋白是研究RNA功能的必要步骤．目前,RNA结合蛋白的分离和鉴定方法较多,但各有优缺点．本实验利用可溶性碳二亚胺(EDC)介导的缩合反应,将A/U富集片段RNA共价偶联到固相介质amine M-270上,再用固定化RNA经亲和层析从细胞抽提物中分离纯化RNA结合蛋白,并以SDS-PAGE联合质谱分析和Western blotting等方法鉴定RNA特异性结合蛋白．最后通过荧光原位杂交和共聚焦显微镜证明这些RNA特异性结合蛋白确与RNA在细胞内结合．实践证明这一方法简单、高效、易于掌握．     

人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）cDNA3′－UTR对其表达的影响

利用人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ３′端非翻译区（３′－ＵＴＲ）中存在的ＤｒａⅠ酶切位点,通过部分酶切与完全酶切,删除３′－ＵＴＲ不同长度,构建了四种ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ瞬时重组表达质粒。转染ＣＯＳ－７细胞后,生物活性测定结果提示,ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ３′－ＵＴＲ对其表达起负调控作用,其关键性序列位于紧接终止密码子ＴＧＡ下游的６５ｂｐ范围内,３′－ＵＴＲ对ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ表达的影响与转录水平的差别有一定关系。     

双链RNA结合蛋白与双链RNA结合域

双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)能引发细胞的抗病毒机制,其产生效应是因为作用于含有dsRNA结合域(dsRNA·binding domain,DRBD)的酶类和其他功能蛋白质,这些蛋白质能够特异性地识别并结合dsRNA,从而引起细胞应答.已有的资料表明DRBD不仅与dsRNA结合,还能与DNA或其他形式的RNA分子结合,而且有些蛋白质的DRBD不与任何核酸分子结合,仅起调节作用.另外,同种蛋白质的不同DRBD之间以及不同蛋白质的DRBD之间也能相互作用,从而形成复杂的蛋白质一蛋白质复合体,参与多种细胞代谢途径.因此,DRBD及其含有这些结构域的蛋白质可能具有多种功能.     

利用RIP-Seq技术鉴定HepG2细胞中与HuR蛋白结合的lncRNAs

长链非编码RNAs（long noncoding RNAs, lncRNAs）可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调节基因的表达,对细胞功能起着重要的调节作用。RNA结合蛋白可与很多的RNA结合,并在转录后水平发挥重要的调节作用。然而,RNA结合蛋白是否可以在细胞内广泛结合lncRNAs对其发挥调节作用,仍需进一步证实。本研究通过RNA结合蛋白免疫沉淀技术联合高通量测序（RNA binding protein immunoprecipitation-high throughput sequencing, RIP-Seq）的方法在人肝癌细胞株HepG2中,鉴定与人抗原R（human antigen R, HuR）蛋白相结合的lncRNA分子,并进行了初步的验证。首先,通过HuR-RIP实验分离与HuR蛋白结合的RNA分子,然后高通量测序及生物信息学分析。根据分析结果,鉴定出HepG2细胞中361条与HuR蛋白结合的lncRNAs分子,包括基因间lncRNA（large intergenic noncoding RNA, LincRNA）、内含子lncRNA、与编码基因正义链有重叠的lncRNA和与编码基因反义链有重叠lncRNA（antisense lncRNA）等。并进一步通过RIP-qPCR技术,对其中20条LincRNA分子进行了定量检测,验证测序结果。在HepG2细胞中敲低HuR基因表达,发现这些LincRNA分子中,11条LincRNA分子表达水平显著降低（P＜0.05）,2条LincRNA显著升高（P＜0.05）,剩余7条LincRNA表达量未发生变化（P＞0.05）。本研究结果说明,HuR在细胞内可以广泛结合lncRNA分子,并且可能对结合的lncRNA分子的表达量产生影响,这也为进一步研究这些lncRNA的功能和HuR调控网络的研究提供了基础。     

烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的:克隆烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白基因(glycine-rich RNA-binding protein,GRRBPs)并进行原核表达,为制备抗体和研究烟草抗逆性分子机理打下基础。方法:从总RNA中反转录扩增并克隆烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白NtRGP-1a和NtRGP-3全长cDNA,将cDNA序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pGEX4T-1/NtRGP-1a、pGEX4T-1/NtRGP-3,转化大肠杆菌rosetta,IPTG诱导表达,GSTrap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果:重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白纯度占总蛋白的95%以上。结论:成功克隆和表达了烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白NtRGP-1a和NtRGP-3基因序列,为制备抗体和烟草抗逆性分子机理等进一步的研究奠定了基础。     

蚕豆叶片下表皮ABA结合蛋白的分离纯化

将ＡＢＡ通过一个１０ 碳原子的臂高效率地（６～８ ｍｍｏｌ／Ｌ凝胶）偶联到琼脂糖凝胶４Ｂ上,制成亲和层析柱,用以纯化蚕豆（Ｖｉｃｉａｆａｂａ Ｌ．） 叶片下表皮ＡＢＡ 结合蛋白（ＡＢＡ＿ＢＰ）。样品上柱后,通过ＮａＣｌ 盐梯度洗脱去掉大部分非特异结合的杂蛋白后,用１ ｍｍｏｌ／ＬＡＢＡ亲和洗脱竞争亲和柱中的ＡＢＡ＿ＢＰ,纯化到一种ＡＢＡ特异结合蛋白,纯化了１１２ 倍。纯化蛋白与ＡＢＡ 最大结合为５８．３３ ｎｍｏｌ／ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ,Ｋｄ 值为２１ ｎｍｏｌ／Ｌ,亚基分子量为４４ ．２ ｋＤ,纯度约为９０ ％ 。纯化的ＡＢＡ结合蛋白具有典型的蛋白质紫外吸收光谱,在２８０ ｎｍ 处有明显吸收峰     

鸭肝N－乙酰氨基葡萄糖结合蛋白的分离纯化

鸭肝Ｎ－乙酰氨基葡萄糖结合蛋白的分离纯化李溪冰,邵东敏,顾建新（上海医科大学生物化学教研室,２０００３２）关键词Ｎ－乙酰氨基葡萄糖结合蛋白;亲和层析动物凝集素作为广泛分布于各种组织及细胞中的能与糖特异结合的蛋白质,其重要性正日益受到重视,对其在体内及...     

结肠癌中p63蛋白表达及临床病理意义

研究结肠癌中p63蛋白表达及与临床病理生物学行为的关系,揭示其在结肠癌中的临床病理学意义.癌旁组织中和结肠癌组织p63阳性率分别为42%和74%.两组间比较存在显著差异(P<0.01).p63阳性率在结肠癌组织浸润达粘膜层、肌层中为62%,在结肠癌组织浸润达浆膜层中为91%,两组间比较存在差异(P<0.05);p63阳性率在发生淋巴结转移的结肠癌组织中为86%.在无淋巴结转移的结肠癌组织中为59%,两组间比较存在差异(P<0.05);p63阳性率在A B期结肠癌组织中为57%,在C D期结肠癌组织中为89%,两组间比较存在差异(P<0.01);p63阳性率在高分化结肠癌组织中为55%,在中低分化结肠癌组织中为87%,两组间比较存在差异(P<0.05).p63表达上调参与结肠癌发生,并与结肠癌侵袭、淋巴结转移和临床演进关系密切.     

人冠状病毒NL63受体结合区蛋白的原核表达纯化与鉴定

人冠状病毒NL63受体结合区蛋白是其免疫学诊断和疫苗研究的主要靶点,在受体吸附、病毒进入细胞及膜融合中起关键作用。本研究在E.coli系统中进行人冠状病毒NL63受体结合区(RBD)大、小蛋白的表达纯化,并对其进行免疫学鉴定。首先密码子优化设计合成了HCoV-NL63的RBD大片段(RL:232-684aa)与小片段(RS:476-616aa)的编码基因,并将其克隆进硫氧还蛋白表达载体pM48,构建了人冠状病毒NL63的受体结合区蛋白(RBD)大(RL)、小(RS)片段与硫氧还蛋白的融合表达质粒;转化E.coli BL21pLys S,利用IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析对蛋白进行纯化,并以表达HCoV-NL63RL与RS蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠血清对重组蛋白进行免疫印迹鉴定。结果表明在37℃,0.8mM IPTG诱导4h时,蛋白表达量达到最高,融合蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后纯度可达95%以上。Western blot显示,两个融合蛋白均与痘苗病毒(天坛株)表达的HCoV-NL63RL与RS蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应。本研究首次在国内用原核系统表达纯化并鉴定了人冠状病毒NL63受体结合区大小蛋白(RL和RS),为人冠状病毒NL63感染的免疫学检测与疫苗研究提供了基础。     

重组大肠杆菌单链结合蛋白性质表征及其在提高焦磷酸测序准确性中的应用

利用基因工程手段表达了分子量约为24 kDa的重组大肠杆菌单链结合蛋白 (r-SSBP),通过凝胶阻滞电泳与DNA熔解温度 (Tm) 影响实验表征了r-SSBP与单链DNA (ssDNA) 结合的特性,结果表明,r-SSBP可以与ssDNA结合,并且能够降低DNA的Tm值,同时还能增大含有单个错配碱基的DNA与完全匹配的DNA的Tm值差异,这一特性在提高单核苷酸多态性检测的特异性方面具有潜在的应用价值。此外,将r-SSBP应用于本课题组开发的高灵敏度焦磷酸测序体系中测定已知序列ssDNA模板,结果表明,r     

白百利烟草愈伤组织细胞细胞分裂素结合蛋白的研究

利用BA-Sepharose 4B亲和层析技术丛白百利烟草(Nicotiana tabacum Baibaili)愈伤组织细胞分离提纯了分子量为4400±100道尔顿的细胞分裂素结合蛋白(CB-蛋白)。在细胞表面、核糖体、线粒体、叶绿体和细胞核上以及在细胞液中都有CB-蛋白存在,而核糖体上的CB-蛋白含量量高。探讨了CB-蛋白的功能。     

绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的5个 cDNA及其下游非编码区

通过3'RACE克隆策略获得绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)Gynostemmin的5个cDNA序列gynostemmin Ⅰ～Ⅴ及其下游非编码区(3′untranslated region,3′UTR).它们的编码区长度除gynostemmin Ⅱ为825 bp外,其余均为831 bp.其下游非编码区的长度分别为279、174、170、161和171 bp.在3′UTR中,gynostemmin Ⅰ比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件,其mRNA的稳定性可能因此受到影响.