激光扫描共聚焦显微镜观察细菌生物膜形成的方法学研究

目的:建立激光扫描共聚焦显微镜观察生物膜形成过程的方法,为进一步研究生物膜的形成机制奠定基础。方法:以临床分离金葡菌X428为研究对象,在盖玻片上形成生物膜,分别于接种后的4、8、12、16、24和48h取出玻片,采用免疫荧光技术标记多糖和细菌,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察生物膜形成情况。结果:取得了生物膜形成过程的不同时间点的CLSM图像,4h时细菌在盖玻片上粘附形成小菌落,8h和12h细菌聚集成簇,多糖基质产生并逐渐增多,至16h形成成熟生物膜结构;24h和48h生物膜已经播散,其结构变小。结论:应用免疫荧光技术和激光扫描共聚焦显微镜技术研究生物膜形成过程是一种简便可行的方法。     

小鼠受精卵早期发育过程中PKB/Akt对p21蛋白表达及定位的影响

初步探讨在小鼠受精卵早期发育过程中PKB/Akt对p21蛋白表达及定位的影响。通过显微操作技术注射野生型、持续激活型及激酶失活型的PKB的mRNA,用免疫荧光方法检测p21蛋白的细胞定位、Western blot方法检测p21蛋白的表达。结果显示在注射不同形式的PKB mRNA后p21蛋白的表达无明显差别,但是细胞定位发生改变,PKB被激活后,p21蛋白滞留在胞浆中。因而初步认为在小鼠受精卵中,PKB/Akt通过影响p21的细胞定位而影响细胞周期的进程。     

鼻咽癌细胞对HA的粘附作用及微丝的共聚焦显微镜观察

本文研究了人鼻咽癌上皮细胞系ＣＮＥ－２Ｚ对透明质酸（ＨＡ）的粘附作用及其粘附后微丝的改变,结果表明,鼻咽癌细胞粘附的ＯＤ值随ＨＡ浓度的升高而升高,３００μｇ／ｍｌ、１２５０μｇ／ｍｌ组与对照组比较有极显著性意义,Ｐ＜０．０１;癌细胞粘附的ＯＤ值随培养时间延长而升高,２４０ｍｉｎ组及１２０ｍｉｎ组与６０ｍｉｎ组比较有极显著性意义,Ｐ＜０．０１。ＬＳＭ观察ＨＡ浓度为３００μｇ／ｍｌ时培养４ｈ和２４ｈ的癌细胞微丝的分布明显不同,培养４ｈ的癌细胞呈圆形,微丝均匀地分布于胞浆内;培养２４ｈ的癌细胞呈不规则形,微丝主要分布于与ＨＡ的粘附面上。上述结果提示ＨＡ可促进鼻咽癌细胞粘附,癌细胞与ＨＡ结合后可诱导ＭＦ重组     

应用激光扫描共聚焦显微镜研究卵母细胞和早期胚胎的细胞骨架

介绍了应用激光扫描共聚焦显微镜, 结合免疫荧光技术研究卵母细胞和早期胚胎细胞骨架的方法.观察了β-微管蛋白、γ-微管蛋白、微丝以及染色体在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的分布和形态, 讨论了实验过程中的注意事项以及实验结果的分析和处理方法.     

小鼠受精卵早期发育过程中PKB/Akt对p21蛋白表达及定位的影响

初步探讨在小鼠受精卵早期发育过程中PKB/Akt对p21 蛋白表达及定位的影响。通过显微操作技术注射野生型、持续激活型及激酶失活型的PKB的mRNA,用免疫荧光方法检测p21蛋白的细胞定位、Western blot 方法检测p21蛋白的表达。结果显示在注射不同形式的PKB mRNA 后p21蛋白的表达无明显差别,但是细胞定位发生改变,PKB被激活后,p21蛋白滞留在胞浆中。因而初步认为在小鼠受精卵中,PKB/Akt通过影响p21 的细胞定位而影响细胞周期的进程。     

胸腺肽-β4在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达与分布规律

胸腺肽-β4(thymosin-β4,Tb4)是一种重要的 G-actin遮蔽因子(G-actin sequestering factor),在细胞微丝活动中有着调节G-actin活性的作用． 以往报道证实了Tb4在细胞中具有广泛的生理作用,但其在哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育等方面的作用,迄今还没有系统的研究报道． 以昆明白小鼠卵巢、卵母细胞和早期胚胎作为实验材料,以免疫( 荧光) 组织化学和RT-PCR技术为主要研究方法,对Tb4的表达与分布进行了研究． 结果显示,Tb4在相关发育过程中,存在差异性的表达和定位变化．结果表明,在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎的发育过程,Tb4能够通过表达与分布的变化对细胞微丝活动和细胞增殖活动进行调控,对小鼠卵母细胞成熟、早期胚胎发育以及胚胎着床过程有重要的作用．     

胸腺肽-β4在小鼠卯母细胞和早期胚胎中的表达与分布规律

胸腺肽-β4(thymosin-β4,Tb4)是一种重要的G-actin遮蔽因子(G-actin sequestening factor),在细胞微丝活动中有着调节G-actin活性的作用.以往报道证实了Tb4在细胞中具有广泛的生理作用,但其在哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育等方面的作用,迄今还没有系统的研究报道.以昆明白小鼠卵巢、卵母细胞和早期胚胎作为实验材料,以免疫(荧光)组织化学和RT-PCR技术为主要研究方法,对Tb4的表达与分布进行了研究.结果显示,Tb4在相关发育过程中,存在差异性的表达和定位变化.结果表明,在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎的发育过程,Tb4能够通过表达与分布的变化对细胞微丝活动和细胞增殖活动进行调控,对小鼠卵母细胞成熟、早期胚胎发育以及胚胎着床过程有重要的作用.     

激光扫描共聚焦显微镜对人类染色体三维结构的观察

为了获得染色体内部结构的多种信息,以及对染色体形态构建提供有益的尝试,本试验利用荧光染料的特异性标记及激光扫描共聚焦显微镜的连续断层扫描和三维重建的特点,对人类染色体的形态结构进行观测,结果显示：本方法不仅能显示染色体的荧光带纹的分布状况,而且能作染色体内部的一系列光学切片和染色体三维结构的观测。     

激光扫描共聚焦显微镜术中活细胞标本的制备

激光扫描共聚焦显微镜是以单个的、活性的、贴壁的细胞标本为主要的研究对象。为了获得适合共聚焦显微镜分析的组织细胞标本,本文讨论了标本制备存在的一些问题并提出了改进的方法。结果显示：组织细胞外环境中盐溶液、ｐＨ值、温度、氧气等均为影响细胞活性的重要因素;而且细胞的贴壁效果也是观测分析的关键条件之一。本文对激光扫描共聚焦显微镜术中的组织细胞学方法进行了探讨,并为此提供一些有实效的实验方法。     

激光共聚焦显微镜在微痕定量分析中的应用综述

微痕分析是石器、骨器、牙齿等工艺、功能研究的常用方法,但无论是高倍还是低倍等常用方法,受限于体式光学显微镜、扫描电镜等观察方法,微痕分析通常很难进行原位定量分析,因此微痕分析的定量化是目前学术界遇到的主要问题。近年来随着激光共聚焦显微镜（LSCM）在微痕分析中的应用,微痕定量化在西方学术界得到了新的实践和进展。本文主要介绍激光共聚焦显微镜的原理及其在微痕分析中的应用案例,以期促进微痕分析在中国的进一步发展。     

用激光共聚焦显微术在小鼠卵母细胞中检测蛋白激酶C

用免疫荧光化学与激光共聚焦显微术结合的方法研究了小鼠卵母细胞中蛋白激酶C(PKC)α和βⅠ的表达和定位,以及蛋白激酶C(PKC)和皮质颗粒的双标记,探讨了以哺乳动物卵母细胞为实验对象进行免疫荧光共聚焦显微研究的简便方法.结果发现,PKC α和βⅠ在小鼠生发泡期和MⅡ期卵母细胞中都有表达,但表达部位存在差异.说明采用改进的激光共聚焦显微术,可以方便、灵敏地检测特异蛋白质在卵母细胞中的表达部位,从而为生殖、发育研究提供有效手段.     

中国对虾卵子活化及卵裂的激光扫描共聚焦显微镜研究(英文)

有报导,与其它动物不同,对虾的卵子一接触海水、不经过受精,就可以被活化。但是,只有受精卵才能卵裂发育。而且,各种对虾卵子内皮质棒及皮层颗粒的形态结构、活化过程各有不同。本文就中国对虾卵子的活化及卵裂过程进行了激光扫描共聚焦显微镜（ＬＳＣＭ）研究。该技术可以清晰地显示细胞的立体图像。采集中国对虾,人工诱导产卵,未受精卵取自产卵虾体内,受精卵分期分批取样,固定。供试样品经ＰＢＳ漂洗,ＡＯ、ＦＩＴＣ和ＰＩ染色,ＬＳＣＭ观察、图像处理。刚产出的、未活化卵子形态不规则,皮层内富含皮质棒和皮层颗粒（Ｆｉｇ１）。不论受精与否,产入海水的卵子都能被激活并恢复减数分裂。活化后的卵子释放出皮层囊泡内的皮质棒（Ｆｉｇｓ２＆３）。释放出的皮质棒转变为均质的胶质层（Ｆｉｇｓ４＆５）。随后,皮层颗粒释放并在卵子表面转化为均质化的孵化膜。卵子开始举起,与孵化膜之间形成卵周隙。卵周隙内具有絮状物质（Ｆｉｇｓ６,７＆８）。卵子产出后笫８～１０ｍｉｎ,经过减数分裂,第一极体排放,并随着孵化膜的举起而被推向卵外（Ｆｉｇ５）。笫２０ｍｉｎ,第二极体排放,并由卵子表面到达孵化膜的内缘（Ｆｉｇ６）。在２０℃水温条件下,受精卵产入海水中６０     

激光扫描共聚焦显微镜在蛋白质晶体生长研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜与普通光学显微镜相比,其分辨率高,同时具有可对样品进行非侵入性无损伤断层扫描,以及对样品形貌进行三维成建等特点,因此,可作为研究晶体生长强有利的工具。本文介绍了其在定量测量晶体的个数,重组三维图像以获得晶体生长的过程信息及测定晶体生长台阶动态变化等方面的应用。还对激光扫描共聚焦显微镜在晶体生长研究的其它方面应用前景作了展望。     

共聚焦激光扫描显微镜在发育生物学中的应用

共聚焦激光扫描显微镜以高空间分辨率、非介入无损伤性连续光学切片、实时动态观察等优越性,应用于生物医学众多领域中。本文主要论述共聚焦激光扫描显微镜在发育生物学中的应用。     

IPL作用下鼠皮形态改变的显微观察与初步分析

观察光子嫩肤(IPL)后鼠皮的形态学随时间的改变情况,如:表皮层、真皮层的增厚或变薄的情况。探讨IPL作用下,皮肤的表皮、真皮厚度变化与IPL在特定波长的能量密度的关系。以小白鼠作为研究对象,先去毛,用IPL在一定波长不同的能量密度照射活体小白鼠皮肤,分别在照射前、照射后,以及之后的1天,3天,7天应用激光共聚焦显微镜观察皮肤内部的结构,并对其不同的能量密度与照射前相比进行分析,讨论了真皮胶原蛋白在组织的修复过程的作用及其中的关键因素。     

活细胞钙动态的共聚焦扫描显微镜检测技术

共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scarming Microscope,CLSM）广泛应用于活细胞内钙敏感探针标记的钙水平的动态测量。较之传统的显微镜CLSM在钙成像分析上有着不可比拟的优越性,但也存在一些缺陷,近些年陆续出现了一些针对这些缺陷的改善措施,如比率法、葡聚糖探针及其他一些新技术与共聚焦显微镜的联合应用等,并且出现了诸如双光子显微镜等新型激光共聚焦显微镜。随着共聚焦钙成像技术的不断发展进步,其今后的应用前景将会越越广阔。     

Semiquantitative Confocal Laser Scanning Microscopy Applied to Marine Invertebrate Ecotoxicology

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) represents a powerful, but largely unexplored ecotoxicologic tool for rapidly assessing in vivo effects of toxicants on marine invertebrate embryo quality and development. We describe here a new semiquantitative CLSM approach for assessing relative yolk quantity in marine invertebrate embryos (harpacticoid copepods) produced by parents reared from hatching to adult in the polycylic aromatic hydrocarbon chrysene. This method is based on fluorogenic labeling of embryo yolk and subsequent statistical analysis of areal pixel intensities over multiple Z-series using a general linear model (GLM)–nested analysis of variance. The fluorescent yolk-labeling method described here was able to detect statistically significant differences in yolk concentrations in marine copepod (Amphiascus tenuiremis) eggs or embryos from females exposed to ultraviolet light and chrysene-contaminated sediments. Yolk intensities in embryos from females cultured throughout their life cycles in clean sediments were statistically identical with or without UV exposure. In constrast, yolk intensities in embryos of females cultured throughout their life cycle in chrysene-contaminated sediments were significantly higher in the non-UV-exposed treatment with chrysene at 2500 ng/g sediment (65.7% higher) and the UV-exposed treatment with chrysene at 500 ng/g sediment (76.6% higher).     

利用激光扫描共聚焦显微术对同源四倍体水稻胚囊形成与发育的进一步观察

应用改进的整体染色透明激光扫描共聚焦显微术(WCLSM),对同源四倍体水稻PDER-2B-4x胚囊的形成与发育过程进行观察。发现其胚囊的形成发育过程与二倍体的一致,可以清楚地划分为8个发育时期,即孢原细胞形成期、大孢子母细胞形成期、大孢子母细胞减数分裂期、功能大孢子形成期、单核胚囊形成期、胚囊有丝分裂期、八核胚囊发育期和成熟胚囊期。除正常发育的过程外,大孢子发育的各个过程均出现一些异常现象,包括:细胞退化、核位置异常、核数目异常和细胞分化异常等。这些异常可能最终导致多种结构异常成熟胚囊的形成。     

双光子及共聚焦激光扫描显微术研究天花粉蛋白对人绒癌细胞的作用机制

天花粉蛋白(trichosanthin, TCS)是从中草药栝楼根中提取的一种核糖体失活蛋白,具有抗肿瘤和抗HIV功能.应用双光子及共聚焦激光扫描显微术结合特异性荧光探针Hoechst 33342、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸酯 (DCFH-DA)、Indo-1和Fluo 3-AM,首次同时观察了TCS诱导人绒癌细胞（JAR细胞）凋亡过程中活性氧自由基（ROS）和细胞内钙离子浓度（［Ca²⁺］_i）的变化,实验结果表明TCS引起的［Ca²⁺］_i升高和ROS形成参与了TCS诱导的JAR细胞凋亡,并且ROS形成和［Ca²⁺］_i升高有关.共聚焦激光扫描显微术的研究结果表明,［Ca²⁺］_i升高不是导致ROS形成的主要原因,TCS诱导产生的ROS可能是通过TCS与JAR细胞膜表面受体作用介导的.     

共聚焦显微技术研究SA对蚕豆气孔保卫细胞的影响

水杨酸(salicylic acid,SA)作为植物体内一种内源性的信号分子,具有多种生理功能.实验表明水杨酸以浓度依赖的方式诱导气孔关闭,抑制气孔张开.20U/mL的CAT与SA共同处理时可逆转SA诱导气孔关闭作用的83%~90%.以H2O2荧光探针H2DCFDA结合激光扫描共聚焦显微术直接检测到SA处理可引起保卫细胞内H2O2的产生;在保卫细胞内显微注射CAT可完全阻止SA导致的DCF荧光增强.表明SA诱导的气孔关闭可能与H2O2的产生有关.