HLA-Ⅱ类基因DRα及DRB1 *0401转基因小鼠模型的遗传与繁殖

采用类系祖建系的方法 ,对HLA -Ⅱ类基因DRα 和DRB1 　 0 4 0 1转基因小鼠模型进行了繁育。通过PCR和Southernblot分子杂交的方法 ,检测小鼠尾组织的DNA样品 ,以确定DR基因的整合和复制情况。结果表明 ,HLA -Ⅱ类基因DR已稳定地遗传至第五代(F5) ;共产仔 32 6只 ,PCR检测出阳性小鼠 95只 ,阳性率为 2 9.1 %。PCR—Southern印迹杂交检测 ,发现 68只仔鼠整合有DR基因 ,总有效率为 2 0 9%。经Nothern杂交和RT -PCR检测HLA -DR基因在脾脏和肾脏中均有表达。     

基因扩增产物的固相杂交-酶联显色方法的建立

建立基于基因扩增技术的简便、快速的病毒核酸定量检测方法．将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的病毒基因产物,与通过共价键结合在微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值．应用本方法对血清中乙型、丙型肝炎病毒核酸定量检测,灵敏度分别可达１－５拷贝／反应．此方法简便、快速、特异性好、敏感性高、半定量指标客观,可广泛应用于肝炎病毒感染的临床诊断和疗效评价．     

HLA-Ⅱ类基因DRα及DRB_1~*0401~1转基因小鼠的制备

利用受精卵原核的显微注射技术 ,将人类HLA Ⅱ类DRα及DRB1 0 4 0 1两种基因 ,显微注射至C5 7BL 6×DBA 1杂交小鼠受精卵中 ;并移植至假孕受体鼠的输卵管内。实验先后有 8只鼠妊娠 ,稳定遗传五代 ,经PCR检测 95只HLA DRα、DRB1 0 4 0 1阳性。α 32P dCTP斑点杂交与Southern印迹杂交鉴定出 6 8只整合含有DRα及DRB1 0 4 0 1混合型的转基因小鼠 ,有效率为 2 0 .9%。经Northern杂交[1] 和RT PCR检测 ,其HLA DRα、DRB1 0 4 0 1基因在脾脏和肾脏中均有表达。结果说明 ,携带人类HLA Ⅱ类DRα和DRB1 0 4 0 1基因的转基因动物模型构建成功。     

PCR扩增TCRVδ2－Dδ3片段的临床价值

以巢式PCR扩增急性淋巴细胞白血病细胞中TCRVδ2－Dδ3重排片段,同时将生物素掺入初诊期骨髓标本扩增产物中,标记成患者克隆特异性探针,通过点杂交法检测缓解期患者体内残留的白血病细胞．结果提示该法对于临床病情监测有一定的价值．     

湖南地区汉族人群p53基因第72位密码子多态性与宫颈鳞癌的相关性

目的：探讨宫颈组织p53基因第72位密码子的多态性及分析第72位密码子的多态性与湖南地区汉族人群宫颈鳞癌的相关性。方法：采用PCR方法扩增101例正常宫颈和150例宫颈鳞癌石蜡组织p53基因第72位密码子基因,回收目的片段进行测序。采用SPSS11．5软件分析p53基因第72位密码子的多态性。结果：p53第72位密码子基因测序结果显示,在宫颈鳞癌组织中Arg／Arg、Pro／Pro、Arg／Pro所占比例分别为40．66％、16．67％、42．67％;在正常宫颈组织中Arg／Arg、Pro／Pro、Arg／Pro所占比例分别为47．53％、7．92％、44．55％。统计学分析结果显示,Arg／Arg和Arg／Pro基因型在宫颈鳞癌和对照组中的表达差异没有统计学意义（P〉0．05）;Pro／Pro基因型在宫颈鳞癌组中所占比例显著高于正常宫颈组织（P〈0．05）。结论：p53基因第72位密码子Pro／pro基因型是湖南地区女性发生宫颈鳞癌易感因素。     

昆虫杆状病毒衣壳主蛋白基因的PCR扩增,克隆和定位

用ＰＣＲ技术成功地扩增了苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的衣壳主蛋白基因（ｖｐ３９基因）,并克隆了该基因,利用纯的ｖｐ３９基因探针,在低严谨杂交条件下,已将粘虫核型多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ｖｐ３９基固定位在ＰｓｔＩ－Ｆ,ＢａｍＨＩ－Ｃ,ＥｃｏＲＩ－Ｃ,ＸｈｏＩ－Ｄ,Ｉ,ＥｃｏＲＶ－Ｈ,Ｘ等片段上。ＰＣＲ反应时,在扩增出预期的包括完整ｖｐ３９基因的１４０６ｂｐ片段的同时也扩增出一条Ｃａ．４００ｂｐ的片段,本文讨论了ＰＣＲ的特异性扩增和非特异性扩增。     

转基因烟草检测技术研究

本研究建立了转基因烟草常用调控基因35S启动子和nos终止子,标记基因npt-II和目的基因TMV－CP的PCR检测技术,并用轻构建的pUC18质粒提纯的35S启动子和nos终止子基因经地高辛标记后制成了基因探针,建立了检测35S启动子和os终止子的分子杂交技术,杂交试验证明,PCR扩增的35S启动子和nos终止子为特异性扩增产物,此项检测技术具有快速,特异,敏感,经济以及可重复性强等优点。     

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术,结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV）,采用MHV－3,MHV－A59病毒株感染DBT细胞,37℃培养,待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物,进行RT－PCR扩增,结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA,同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。     

甘肃裕固族HLA—DRB1基因多态性及其族源分析

目的：研究甘肃裕固族HLA—DRB1基因的多态性,探讨裕固族的起源、迁徙及其与其他民族的关系。方法：应用PCR-SSP基因分型技术,对54例裕固族个体进行了HLA-DRB1位点的基因分型并进行相应等位基因频率的比较。结果：甘肃裕固族HLA-DRB1位点共检出了14种等位基因,其中高频基因为DR5（0、2115）,DR4（0、1346）和DR7（0．1250）,低频的等住基因为DR14（0．0096）和DR13（0．0192）;裕固族人HLA-DRB1座位等位基因总的分布格局与蒙古族最接近,与云南黎族则相差较远。结论：对裕固族和我国各地人群的HLA-DRB1频率进行了聚类分析,极为相似的HLA-DRB1背景提示裕固族和蒙古族之间密切的遗传关系。     

非放射性反相杂交法在HLA－DQA1位点基因分型中的应用

将遴选的经适当接尾的１２个ＨＬＡ－ＤＱＡ１序列特异性寡核苷酸固定在一张滤膜上,用生物素标记的ＤＱＡ１特异性扩增产物与滤膜上的序列特异性寡核苷酸在四甲基氯化铵杂交体系中杂交,然后经洗膜封膜,杂交信号用非放射性的碱性磷酸酶显色法检测,根据杂交斑点的显示结果分析标本的基因型。采用这种方法初步确定了ＨＬＡ－ＤＱＡ１位点８种单倍型等位基因：ＤＱＡ１０１０１、０１０２、０１０３、０２０１、０３０１１、０４０１、０５０１和０６０１．非放射性反相杂交法可对各种来源的杂合性标本进行ＨＬＡ－Ⅱ类基因快速分型,并适合在临床器官移植的组织分型配型、疾病易感性研究和法医鉴定等领城中应用。     

非放射性反相杂交法在HLA—DQA1位点基因分型中的应用

将遴选的经适当接尾的１２个ＨＬＡ－ＤＱＡ１序列特异性寡核苷酸固定在一张滤膜上,用生物素标记的ＤＱＡ１特异性扩增产物与滤膜上的序列特异性寡核苷酸在四甲基氯化铵杂交体系中杂交,然后经洗膜封膜,杂交信号用非放射性的碱性磷酸酶显色法检测,根据杂交斑点的显示结果分析标本的基因型。     

应用PCR-SSOP技术研究中国汉族、维吾尔族HLA-A基因座基因多态性

人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen,HLA)基因复合物位于6p21.3,有220多个不同的功能基因,是人类基因组最复杂的遗传多态系统。HLA等位基因的变异在医学、法医学、人类学等领域具有重要的意义。自从1964年以来,HLA分型一直采用经典的微量淋巴细胞毒实验,但该方法是血清学水平的分,不能识别很多特异性的等位基因,而且高质量的抗体也不易获得。从20世纪90年代起,在国家自然科学基金的资助下,首先开展HLAⅡ类位点基因分研究及大规模群体多态性调查,所获得的中国主要民族基因数据已应用于多个领域。相比之下,HLAⅠ类基因数量更丰富,包含了A、B、C、E、F、G和假基因H、J、K、L等10个位点;基因分子结构更复杂,更具多态性。因此,HLAⅠ类DNA分型比HLAⅡ类分型及行多困难。直至目前中国人群HLA－A基因座基因多态性和分布频率的研究尚未充分进行。而任何DNA标记用于遗传分析、法医鉴定等领域之前,必须先进行群体调查,建立不同民族基因数据库,这是不可逾越的基础工作。鉴于此,采用灵敏而非同位素污染的PCR－SSOP基因分型技术,对165个汉族和162个维吾尔族个体的HLA－A基因座多态性进行调查。结果在汉族群体中发现22种等位基因,频率最高的是HLA－A＊1101（19．7％）,其次是＊201（12．72％）;在维族群体中发现22种等位基因,频率最高的是＊2407（17．90％）,等位基因＊0101、＊0201和＊3301的频率均大于10％;HLA－A＊0203、＊0205、＊0302、＊2403和＊3302仅在汉族群体中检出;HLA－A＊0205、＊0211、＊2301、＊2502、＊68012和＊6802仅在维族群体中检出。按照Hardy-Weinberg平衡定律检验,两个民族各等位基因型频率的预期值与实际观察值相吻合（P＞0．05）,证明了所获得汉族、维吾尔族HLA－A位点基因频率具有可靠性;同时也表明各等位基因的遗传特征符合符合孟德尔规律。经计算机统计分析,汉族群体HLA－A基因座杂合度（Heterozygosity,H)、个体识别率（Discrimination Power,DP)和非父排排率（Proba-bility of Paternity Exclusion,EPP)分别为0．9029、0．9776和0．8592;维族群体H、DP和EEP分别为0．9063、0．9379和0．7885。和其他遗传标记（如VNTR、STR、SNP）的单一位点相比,HLA－A具有高度的杂合率、个体识别率和非父排除率。因此,HLA－A等位基因在法医个体识别、亲权鉴定、基因诊断、人类学等领域具有重要的应用价值。     

PCR—ELISA检测HBV DNA的研究

目的：建立一种敏感、特异的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测方法。方法：应用PCR扩增技术和核酸杂交技术结合酶促显色技术（即PCR－ELISA技术）来检测血清中的HBV DNA。结果：应用PCR－ELISA技术能够检出许多PCR琼脂张胶电泳所检测不到的HBV DNA,大大地提高了检出率,而且,特异性强。结论：PCR－ELISA方法灵敏度高,行异性强,检测结果数据化,不受主观因素的影响。     

格特隐球菌IGS5b基因亚型和a交配型菌株的鉴定

目的鉴定1株格特隐球菌VGⅢ基因型中的少见基因亚型IGS5b及a交配型菌株。方法采用PCR指纹法、基因内间隔区（IGS）和磷脂酶基因（PLB1）测序分析鉴定基因型。采用PCR特异扩增法和交配试验鉴定交配型。采用GEF1基因序列分析同步鉴定基因型和交配型。结果结合PCR指纹法和序列分析,鉴定受试株RV63979为VGⅢ基因型中的少见基因亚型。针对交配型位点内STE12和STE20基因的特异性引物均扩增阴性。交配试验证实为a交配型。GEF1位点测序准确鉴定其基因型和交配型。结论本文通过多种鉴定手段结合IGS序列分析,鉴定1株VGⅢ基因型中的少见基因亚型IGS5b,证实VGⅢ基因型中至少存在IGS5a和IGS5b2种基因亚型。交配型分析表明该菌为VGⅢ基因型中少见的a交配型。     

人癌细胞内质网分子伴侣Grp94基因近3′端的初步分析

采用PCR及RT－PCR方法结合核酸分子杂交技术,首次确定了与Grp94cDNA2231～2500碱基片段对应的Grp94基因序列上有内含子．含有内含子的扩增片段长约708bP．对三种癌细胞系进行了PCR和RT－PCR反应,电泳结果显示存在差异．研究结果为进一步探讨Grp94基因3'端精细结构及其在正常细胞和肿瘤细胞中表达的改变打下了基础．     

广西壮族自治区HIV-1流行毒株的基因序列测定和亚型分析

使用ＰＣＲ技术对１４份广西ＨＩＶ－１阳性感染者外周血单核细胞（ＰＢＭＣｓ）样品进行扩增,获得ＨＩＶ－１膜蛋白（ｅｎｖ）基因的核酸片段,并对其Ｃ２－Ｖ３及邻区３５０－４５０个核苷酸序列进行了测定和分析。结果表明,１４份样品中９份为泰国Ｂ（Ｂ′）亚型,５份为Ｅ亚型毒株。其中Ｂ′亚型毒株的基因离散率为４．２％,与Ａ－Ｅ参考亚型及部分Ｂ亚型代表株序列相比较,与包括泰国、缅甸及云南德宏在内的Ｂ亚型毒株序列十分接近,相互之间基因离散率在３．０％－４．４％的范围内;而Ｅ亚型毒株的基因离散率为２．１％,与国际Ｅ亚型毒株的基因离散率最近,为５．６％,与其它国际参考亚型基因离散率很远,在２１．１％－２７．３％。根据以上数据及其它资料提示,广西存在Ｂ′和Ｅ两种亚型的ＨＩＶ－１的流行,且其Ｂ′亚型毒株的传入,与流行在云南德宏州的相同亚型ＨＩＶ－１毒株密切相关,而Ｅ亚型毒株则可能是由泰国经越南传入广西的     

传染性支气管炎病毒江苏分离株核蛋白基因序列测定与同源性分析

将本室鸡传染性支气管炎病毒（IBV）江苏省地方分离肾型毒株JS／95／03接种鸡胚,分离、纯化病毒,提取单股RNA做为反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）的扩增模板。用Genbank公开序列多重比较后设计一对引物,使用单管RT－PCR方法,物异扩增IBV核蛋白（N）基因5'端854bp的片段,扩增产物纯化后测,序列分析表明,IBV N基因也存在较大变异,此毒株与呼吸型疫苗株M41序列同源性最高。     

广西壮族自治区HIV—1流行毒株的基因序列测定和亚型分析

使用ＰＣＲ技术对１４份广西ＨＩＶ－１阳性感染者外周血单核细胞（ＰＢＭＣｓ）样品进行扩增,获得ＨＩＶ－１膜蛋白（ｅｎｖ）基因的核酸片段,并对其Ｃ２－Ｖ３及邻区３５０￣４５０个核苷酸序列进行了测定和分析。结果表明,１４份样品中９份为泰国Ｂ（Ｂ＇）亚型,５份为Ｅ亚型毒株。其中Ｂ＇亚型毒株的基因离散率为４．２％,与Ａ－Ｅ参考亚型及部分Ｂ亚型代表株序列相比较,与包括泰国、缅甸及云南德宏在内的Ｂ亚型毒株序列十     

扩增基础上的已知点突变检测进展

在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中,单碱基突变占了相当大的比例,其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题。本文着重介绍了几种近年发展起来的新技术：反向限制性位点突变分析（iRSM)、荧光PCR（SYBR Green I结合熔解曲线分析技术、荧光共振能量转移（FRET）结合探针熔解曲线分析技术）、基因芯片、等位基因特异性扩增技术（ASPCR）。     

原位杂交及原位PCR检测幽门螺杆菌

本研究建立了检测幽门螺杆菌的原位杂交和原位ＰＣＲ技术,采用ＰＣＲ掺入的方法标记原位杂交的生物素探针,６份ＨＰ阳性胃活检组织冰冻切片杂交均为阳性,６份阴性对照组织为阴性。９／１２份ＨＰ阳性对照组织石蜡切片杂交阳性,２份阴性对照切片为阴性。３份阳性对照猫胃粘膜冰冻切片杂交也是阳性。原位ＰＣＲ的引物来自ＨＰ的１６ｓｒＲＮＡ基因,在扩增过程掺入生物素基因。４／４例ＨＰ阳性人胃粘膜冰冻切片原位扩增阳性,２／