猪PR-39抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达

[目的]在毕赤酵母中表达抗菌肽PR-39基因,获得有抗菌活性的PR-39。[方法]根据酵母和猪密码子偏好性,对其密码子进行优化改造。将经SOE-PCR获得的PR-39基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组载体pPIC9K-PR-39。经SacⅠ线性化电击转化毕赤酵母GS115,取阳性克隆进行髙拷贝转化子筛选和诱导表达。[结果]pPIC9K-PR-39重组质粒构建成功,pPIC9K-PR-39菌株发酵产物检测结果对DH5α大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效果。[结论]获得了PR-39基因的重组酵母,并用毕赤酵母系统成功地分泌表达了具有明显抗菌活性的抗菌肽PR-39。     

小鼠IL-35基因毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的构建真核酵母表达载体pPIC9K与小鼠IL-35基因的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,在毕赤酵母GS115菌株中诱导表达,并对其进行鉴定。方法以pET-30a-mIL-35为模板,用PCR扩增出IL-35去信号肽基因全序列,并在3'端引入His标签,构建重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,经SalⅠ线性化重组质粒后,用电穿孔方法将该基因转染毕赤酵母细胞内。经G418梯度筛选高拷贝转化子,筛选Mut+表型后经PCR进一步鉴定IL-35基因与酵母染色体是否整合。小量诱导表达筛选出高表达菌株,大量甲醇诱导表达,以SDS-PAGE及免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白表达。结果小鼠IL-35基因真核酵母表达载体pPIC9K-mIL-35-His构建成功,并且在GS115中通过甲醇诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot分析,可见相对分子质量约为65 000的目的蛋白。结论实验所构建的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His可在毕赤酵母GS115中正确的表达小鼠IL-35基因。     

合成耐高温α-淀粉酶PFA在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

PFA是来源于Pyrococcus furious的一种耐高温α-淀粉酶,为了使PFA能够在巴斯德毕赤酵母中高效表达,根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性对PFA的基因序列进行密码子优化,人工合成耐高温淀粉酶PFA基因pfa,并连接到巴斯德毕赤酵母中表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-pfa。重组质粒线性化后转化到巴斯德毕赤酵母菌株GS115中,重组菌株在摇瓶中用甲醇诱导表达,分泌表达酶活最高为220U／L。     

抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

利用巴斯德毕赤酵母系统表达抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽简称LfcinBD,获得的表达产物具有较强的抗菌活性.将人工设计的用化学合成法合成的以酵母偏爱密码子编码的LfcinBD基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinBD通过限制性内切酶Sac Ⅰ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母GS115宿主菌,G418抗性筛选,得到高拷贝转化子.经PCR检测,LfcinBD基因与毕赤酵母染色体稳定整合.阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinBD,诱导表达5 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验.结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽衍生肽基因已整合到酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较强抗菌活性的抗菌肽,而且对氨苄青霉素抗性的大肠杆菌亦有较强的抑菌作用.     

钙网蛋白-N58在毕赤酵母中的表达及活性分析

目的：利用毕赤酵母表达系统表达Calreticulin-N58蛋白。方法：利用重叠延伸PCR方法合成Calreticulin-N58基因,构建成分泌型的重组表达载体pPIC9K-CRT-N58。该重组表达载体经SacI线性化后,电激转化入毕赤酵母GSll5,经MD板和不同浓度G418筛选得到多拷贝重组菌株。经甲醇诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,在鸡胚中进行活性分析。结果：重组质粒pPIC9K-CRT-N58在毕赤酵母中经甲醇诱导能分泌表达CRT-N58蛋白,摇瓶表达量大约为60mg／L,纯化的目的蛋白有显著的血管生成抑制作用。结论：实验成功地在毕赤酵母表达系统中实现了Calreticulin-N58的分泌表达。为Calreticulin-N58蛋白的进一步药用研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3基因在毕赤酵母中的表达及分析

旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达.将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-EtCDPK3.重组质粒通过电击转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞.重组酵母细胞在含1％甲醇的BMMY培养基中诱导产生目的蛋白,培养收集1-4d的部分上清.经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为49 kD.Western blotting表明,该蛋白能与兔抗EtCDPK3血清特异性结合.结果表明,柔嫩艾美耳球虫CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达.     

抗对虾白斑综合症病毒单链抗体A1基因在酵母中表达及其与抗原结合活性

通过PCR从噬菌粒载体上扩增一种抗对虾白斑综合症病毒 (WSSV)的单链抗体A1(ScFvA1)基因 ,并构建于大肠杆菌 酵母穿梭质粒载体pPIC9K上。经PCR ,酶切 ,测序鉴定重组克隆 ,发现重组成功。将重组质粒pPIC9K ScF vA1转化毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115中 ,利用甲醇诱导 ,将单链抗体A1在酵母中进行了初步表达。经SDS PAGE电泳 ,发现其大小约为 32KD ,通过ELISA实验 ,证明表达上清液中的单链抗体具有很高的WSSV结合活性。     

乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的表达和分离纯化

将乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因整合到质粒pPIC9K上,构建重组表达载体pPIC9K-coALDH2,用电转导将表达质粒pPIC9K-coALDH2转化至毕赤酵母GS115中,在毕赤酵母中表达经密码子改造的ALDH2。结果表明：重组基因工程菌GS115（pPIC9K-coALDH2）发酵液中蛋白质量浓度为8.40 mg/L,1 mL发酵液中酶活为11.35 mU。     

OSF1在毕赤酵母菌中的分泌表达及其生物活性

为了研究人成骨细胞刺激因子(Human osteoblast-stimulating factor,OSF-1)的生物学活性,构建OSF-1高效毕赤酵母表达菌株并表达纯化具有生物活性的OSF-1。首先通过全基因人工合成的方法合成人osf-1基因,并克隆至毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒pPIC9K/osf-1,线性化后电转化酵母宿主菌GS115,构建P.pastoris GS115/pPIC9K/osf-1,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得多拷贝转化子。阳性表达菌株在25℃,经1%的甲醇诱导表达96 h,重组蛋白的表达量达到最大。经SDS-PAGE电泳分析所表达的重组蛋白约为18 kDa,与人成骨细胞刺激因子相符。表达上清经SP-Sephadex C-50离子交换层析进行纯化,得到纯度达98%以上的OSF-1。Western blotting鉴定该蛋白对人成骨细胞刺激因子抗体具有良好的抗原性。生物活性测定表明提纯的OSF-1能促进鼠成骨细胞MC3T3-E1的增殖和分化。利用重组毕赤酵母高效分泌表达了有生物活性的OSF-1,为进一步开展其抗骨质疏松活性研究及产业化开发奠定了基础。     

灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

TIMP-2在毕赤酵母中的克隆与表达

为了克隆人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）基因,并在Pichia pastoris中表达,根据GenBank上的TIMP-2的氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子,通过化学合成和PCR相结合的方法获得了人的TIMP-2基因全长序列,构建了pPIC9-T2表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,并对表达产物进行了分离纯化和生物学活性分析。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突糖蛋白S。方法:根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物,并在5'引物和3'引物中引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点,2.2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体,再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞,G418筛选鉴定阳性重组子,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测诱导后上清。结果:对pPIC9k-S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因;重组酵母菌诱导表达后,SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量约为82×103,且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论:利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒(河北分离株)纤突糖蛋白S。     

Expression and Antigenic Characterization of the Epitope-G1 of the Bovine Ephemeral Fever Virus Glycoprotein in Pichia pastoris

The epitope-G1 gene of Bovine ephemeral fever virus(BEFV) glycoprotein was synthesised by PCR and cloned into expression vector pPIC9K to construct recombinant plasmid pPIC9K-G1.Then the pPIC9K-G1 was linearized and transformed into Pichia pastoris GS115.The recombinant P.pastoris strains were selected by a G418 transformation screen and confirmed by PCR.After being induced with methanol,an expressed protein with 26 kDa molecular weight was obtained,which was much bigger than the predicted size(15.54 kDa).Deglycosylation analysis indicated the recombinant G1 was glycosylated.Western blot and ELISA tests,as well as rabbit immunization and specificity experiments indicated that the target protein had both higher reaction activity and higher immunocompetence and specificity.The recombinant G1 protein could be used as a coating antigen to develop an ELISA kit for bovine ephemeral fever diagnosis.     

甲型H1N1流感病毒血凝素HA1在糖基工程毕赤酵母中的表达

目的:建立用糖基工程酵母制备流感血凝素的方法 ,研究其免疫原性,为酵母表达流感疫苗提供基础。方法:通过PCR的方法扩增编码H1N1流感病毒血凝素HA1(1～330 aa)的基因片段,将HA1基因克隆到表达载体pPIC9质粒上,电转化到糖基工程酵母中,甲醇诱导表达并用镍亲和层析柱纯化重组蛋白,N-糖苷酶F(PNGF)酶切分析N-糖链,Western印迹验证纯化蛋白,免疫小鼠并测定HA1诱导抗体的滴度。结果:获得HA1基因的酵母重组表达菌株,SDS-PAGE分析可见野生型GS115表达的重组HA1相对分子质量约为100×103,而糖基工程酵母GJK01表达的HA1约为60×103,PNGF酶切后相对分子质量均降至45×103左右;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,野生型和糖基工程酵母表达的HA1分子大小不同是由于不同的N-糖基化修饰引起的。重组HA1免疫小鼠可产生抗HA1抗体,随着抗原剂量的增加,其产生的抗体滴度相应增加;3次免疫后,4μg HA1诱导小鼠产生的抗体滴度最高。结论:利用糖基工程酵母表达制备了低糖化的流感病毒血凝素HA1,该重组蛋白可以诱导小鼠产生HA1抗体,且产生的抗体滴度具有HA1剂量依赖性。     

Protein expression and purification of human Zbtb7A in Pichia pastoris via gene codon optimization and synthesis

Human Zbtb7A was proved to be an important molecular switch in oncogenesis. However, it is difficult to obtain its protein expression in prokaryotic system, due to high G+C content and rare codons in zbtb7a gene. Therefore, to further research the function and application of this protein, we optimized its coding sequence according to the codon bias of Pichia pastoris, synthesized the sequence with two-step PCR and confirmed the accuracy by DNA sequencing. The assembled fragment was introduced into P. pastoris expression vector pPIC9K and the resultant plasmid pPIC9K-zbtb7a-his(6) was transformed into the P. pastoris strain GS115 by electroporation. The products of the transformants induced by methanol were analyzed by 10% SDS-PAGE and identified by Western Blot assay. The expression conditions of the selected transformant were optimized. Additionally, a two-step purification protocol was applied to purify the recombinant protein. The results showed that the synthetic coding sequence of human Zbtb7A was successfully obtained and inserted into pPIC9K vector. Human Zbtb7A protein was expressed in P. pastoris and identified by western blot. The optimal conditions for its expression in P. pastoris were under a final concentration of 1% methanol and a time-course of 4d. Through the two-step purification, Zbtb7A protein was purified in high purity and its production reached up to as high as 18 mg/L. These results indicated that an effective procedure for expressing and purifying human Zbtb7A in P. pastoris was established.     

猪囊尾蚴疫苗候选基因TSO18在酵母中的高效表达

将猪带绦虫六钩蚴TSO18基因亚克隆至毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K_TSO18,电转化毕赤酵母菌GS115,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,并对表达产物进行SDS_PAGE和Western blot分析、脱糖基化分析、分子筛纯化和小鼠免疫接种等表明,目的蛋白得到了高效表达并进行了适度的糖基化,易于纯化且具有免疫活性。在5L发酵罐中目的蛋白表达量达到2.54mg/mL,为制备基因工程疫苗打下了坚实的基础。     

猪囊尾蚴磷蛋白在毕赤酵母中的表达及初步应用

将猪囊虫磷蛋白P2基因克隆到毕赤酵母表达系统分泌性表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-P2。经测序证明基因序列完全正确,从而大量制备重组质粒pPIC9K-P2,并用SalⅠ、BglⅡ 两种内切酶分别线性化,然后分别电转化毕赤酵母菌种GS115,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株,利用MM和MD培养基鉴定重组菌株Mut表型,然后用甲醇进行诱导表达;并对表达产物通过SDS-PAGE、Westernblot和ELISA分析,结果表明,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小为12.6kD,表达量占分泌总蛋白的33%,且具有免疫反应活性的重组磷蛋白,从而解决了囊虫病诊断抗原来源问题并为研制新型猪囊虫疫苗奠定了基础。     

米曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建米曲霉木聚糖酶基因的真核表达载体,并转化巴斯德毕赤酵母,进行分泌表达。方法:以米曲霉总RNA为模板,根据已知的米曲霉木聚糖酶基因序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆木聚糖酶基因cDNA序列,将其与pPIC9K质粒连接构建表达载体后转化毕赤酵母,经MM/MD快慢斑筛选,得到Muts型重组子,进行甲醇诱导表达。结果:克隆得到的cDNA序列全长666 bp,连续编码221个氨基酸;阳性克隆子在诱导培养数天后,将菌液点于RBB-木聚糖平板上,产生了明显的透明圈,表明重组木聚糖酶在毕赤酵母中获得表达。结论:木聚糖酶基因的真核表达载体构建成功,并能够在毕赤酵母中表达。     

自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达研究

目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶(HRS或Jo-1)。方法:PCR扩增Jo-1基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-Jo-1。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用SDS-PAGE和免疫酶斑点法鉴定。结果:PCR产物长约1500bp,与预期1526bp接近;pPIC9k-Jo-1重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库的报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物Jo-1的相对分子质量约55000,免疫酶斑点法证实表达产物具有天然Jo-1分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。结论:Jo-1在巴斯德毕赤酵母中分泌表达成功,为后续研究打下了基础。     

人Mn-SOD cDNA的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,用RT-PCR扩增出人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)cDNA,将其插入含有AOX1基因启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组质粒pPIC9k-MnSOD,转化毕赤酵母GS115,筛选出整合了多拷贝hMn-SOD基因的Mut^ 表型菌株,摇瓶培养,0．5％甲醇诱导表达。SDS-PAGE分析显示,诱导4d的培养上清中hMn-SOD的表达量约为上清总蛋白的32％,酶比活可达247、7u／mg。hMn-SOD在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌性表达。