外源基因引入高等植物

通过利用携带大肠杆菌-Ti杂种质体的根癌病农杆菌可以把在大肠杆菌K-12中无性繁殖基因引入Arabidopsis植物中,这个杂种质体由如下四个因素组成:(1)大肠杆菌     

体外建成带有λ噬菌体DNA片段的重组质体

将大肠杆菌抗四环素及抗氨苄青霉素的质体pBR322的DNA、大肠杆菌λ噬菌体DNA在体外经限制性核酸内切酶Hin d Ⅲ切割,并用T4DNA连接酶连接后,以大肠杆菌K 12 HB 101(recA~- r_k~- m_k~-)为受体进行转化,采用插入钝化(insertional inactivation)方法选择重组质体。利用环丝氨酸浓缩Ap~rT_c~3转化体。在648株Ap~r转化体中选出120个无性繁殖系为Ap~rT_c~3。随机挑出3株含有重组质体的无性繁殖系进行大肠杆菌素     

用遗传工程技术改变根瘤菌寄主专一性

豌豆根瘤菌质体pJB5J1转移到Rh.trifolii菌株中建成了杂种菌株,它可使豌豆形成根瘤,从大型带色素的根瘤中分离到根瘤菌,不仅在豌豆上,而且在三叶草上形成具有固氮能力的根瘤,说明这种杂种菌带有nod~+和fix~+基因,然而固氮表型的丧失也是可逆的。     

被子植物质体遗传的细胞学研究

植物细胞质遗传涉及细胞质中含DNA的两种细胞器——质体和线粒体从亲代至子代的传递。相对来说线粒体遗传的研究远不及质体的多,这可能是线粒体这种细胞器缺乏合适的表型突变体之故。高等植物质体遗传的研究历史可追溯到本世纪初在杂交试验中对叶色遗传的非孟德尔定律的发现,Baur在马蹄纹天竺葵(Pelargonium zonale)中从叶色突变体(白化体)的杂交遗传分析,发现了双亲质体遗传;而Correns在紫茉莉(Mirabilis jalapa)中则发现了单亲母本质体遗传(见Kuroiwa)。此后,对质体基因组突变性状遗传分析的研究,大量的资料说明了在被子植物中存在双亲质体遗传和单亲母系质体遗传两种类型,而后一种占大多数,仅少数是比较有规律的为双亲质体遗传或偶尔是双亲质体遗传。几十年来应用遗传分析的方法对被子植物质体遗传的研究,着重于揭示不同植物种质体的遗传是单亲母系或是双亲质体传递,以及探索杂种核基因对质体传递方式的影响。     

美日生物工程研究的几项成果

一、美国有两个公司的遗传工程组构建一种超分泌酵母突变株,该株是用去掉原凝乳酶(系非活性的)基因的质体(指杂种质体)引入酵母基因组内的,其凝乳酶的分泌效率提高10倍,最高达80倍(ASM News,51(11):560—56,1985)。     

王百合及兰州百合细胞质遗传的细胞学研究

描述了王百合（ＬｉｌｉｕｍｒｅｇａｌｅＷｉｌｓ．）及兰州百合（Ｌ．ｄａｖｉｄｉＤｕｃｈ．）质体和线粒体在生殖细胞及精细胞中的分布和细胞质中ＤＮＡ的状况。在刚形成的王百合的生殖细胞中含有少量的质体和大量的线粒体。当生殖细胞游离在营养细胞质中时,质体在生殖细胞中完全退化消失。ＤＡＰＩ荧光技术进一步证明,在成熟花粉、花粉管中的生殖细胞及其分裂形成的两个精细胞中无任何细胞器ＤＮＡ。兰州百合在小孢子分裂时质体严格地极性分布,造成了刚形成的生殖细胞中即无质体。兰州百合、麝香百合（Ｌ．ｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｍＴｈｕｎｂ．）及其杂种的ＲＦＬＰ分析,也证明兰州百合质体是单亲母系传递的。虽然在不同发育时期的生殖细胞及精细胞中可以观察到线粒体,但在雄配子体时期它们的ＤＮＡ已降解,因此雄性线粒体不能被传递至后代。研究结果提供了百合属的这两个种质体和线粒体具母系遗传方式的细胞学证据,并阐明父系细胞质不能作为遗传传递的机理。     

木薯ftsZ基因分离及在原核生物中功能初步鉴定

ftsZ基因是控制细胞分裂的关键基因,其蛋白能够在分裂位点形成一个环状结构而影响细胞分裂.为了研究木薯质体分裂与木薯淀粉品质形成的关系,根据木薯基因组数据库上的预测序列,设计引物,从木薯基因组中分离了与质体分裂相关的ftsZ家族3个新基因(ftsZ1,ftsZ2,ftsZ3).分别将它们与荧光蛋白基因(GFP)融合,构建了3个原核表达载体pET-fisZ1-GFP、pET-fisZ2-GFP、pET-fisZ3-GFP,并转化大肠杆菌BL21(DE3).通过荧光显微镜观察菌体的表型和分裂,初步鉴定了木薯质体分裂相关基因ftsZ家族对细胞分裂的作用.结果显示:尽管木薯与大肠杆菌的亲缘关系较远,ftsZ基因的同源性较低,但是两者表现出相似的功能,木薯ftsZ基因的表达能严重影响大肠杆菌细胞分裂.这一结果为进一步研究木薯ftsZ家族基因的功能奠定了基础.     

满江红细胞质遗传和变异的初步研究

通过细绿萍（Ａｚｏｌｌａ ｆｉｌｉｃｕｌｏｉｄｅｓ）×小叶萍（Ａ．ｍ ｉｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、细绿萍×墨西哥萍（Ａ．ｍ ｅｘｉｃａｎａ）种间,以及细绿萍×印度萍（Ａ．ｉｍ ｂｒｉｃａｔａ）亚属间正反交杂种Ｆ１ 代叶色变化,揭示杂种一代白化性状是母本细绿萍细胞质遗传的变异。电镜观察发现,白化苗质体结构异常,且淡绿苗组织细胞中含有正常叶绿体和异常质体。推测二者均可能和质体基因变异有关。不同杂交类型苗的白化程度和白化机率存在明显差异,且随着核基因变化呈现规律的变化。据此推测,白化性状也与核基因型密切相关     

问题解答

问为什么花斑枝条的紫茉莉会产生绿色、白色花斑三种植株? 答紫茉莉的花斑枝条是因含叶绿素的正常质体(叶绿体)和不含叶绿素的败育质体在枝条的细胞间分布不匀造成的.叶绿体位于细胞质中,它的遗传属于细胞质遗传.花斑枝条的绿色部分的细胞中含有正常的叶绿体,因而表现绿色;白色部分的细胞中含有败育的叶绿体,因而表现白色;白绿组织交界区域的某些细胞中,则同时含有正常叶绿体的败育叶绿体. 花斑枝条上的杂种能出现绿色、白色和花斑三种植株,是由于接受花粉的花在花斑枝条上着生的位置不同造成的.位于绿色部分的花,卵细胞质里含有正常的叶绿体,其杂种必然是绿色的植株;位于白色部分的花,卵细胞质里只含败育叶绿体,其杂种一定是白色的植株;位于白绿交界位置的花,它的卵细胞质中既有正常叶绿体又有败育叶绿体,所以受精卵细胞质里同     

不同培养条件对胡萝卜根原生质体生长的影响

胡萝卜根原生质体内有橙黄色或橙红色的质体,可以作为亲本的光学标记,有利于进行细胞融合的研究。虽然胡萝卜是植物细胞培养的经典材料之一,但文献中从原生质体得到再生植株的例证(Grambow等1972;吴石君等,1977。)以及胡萝卜属细胞杂种(Dudits等1977)都用悬浮细胞系或愈伤组     

枯草杆菌质粒pUB110与大肠杆菌质粒pBR322构建的杂种质粒及其基因表型表达

用EeoRI酶消化pUB 110和pBR 322 DNA,然后以T4 DNA连接酶进行连接,转化大肠杆菌,从转化体中获得pTZ3、pTZ22和pTZ24三个杂种质粒。研究了pTZ22 DNA的分子特性,从BamHI和PstI酶切片段测出其分子量为5.6×10~6道尔顿,并确定其捻接方向。观察了三个杂种质粒的稳定性,研究了其基因表型表达。同源基因均可表达,Ap~r、TC~r基因在枯草杆菌细胞中不能进行异源表型表达,Km~r基因在大肠杆菌细胞中异源表型表达不充分。     

从普通小麦和天蓝冰草杂种的花药诱导花粉植株

离体培养具56个染色体的小麦(Triticum vulgare)和冰草(Agropyron glaucum)杂种的花药,在附加生长素、椰乳和单核苷酸的MS培养基上,成功地诱导出花粉植株。多数植株为白化体,一部分是绿白条纹体,仅有3株是正常的绿色体。检查根尖细胞染色体证明绝大多数植株为单倍体(2n=28),但发现其中1株是单缺体,只有27个染色体,并出现形态特征上的深刻变化。观察花粉母细胞减数分裂时染色体的行为发现,在1—8对染色体间有局部同源性,二价体表现为棒形端部结合。对白化体叶片细胞的亚显微结构研究表明,细胞中存在质体,但质体的发育受到阻碍,不能形成具有正常片层结构的叶绿体。讨论了具56个染色体的杂种其核型的可能形成过程。     

油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建

根据已知序列设计引物,通过PCR扩增获得质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因序列。先将该酶4个亚基的基因进行拼接,然后将这4个拼接好的片段,克隆到pMD18-T载体上,得到质粒pH BM714。再以质粒pHBM714 DNA为模板,用分别带有CpoI和Asc I酶切位点的引物进行PCR扩增,PCR产物在dTTP的保护下经T4 DNA聚合酶处理,与将质粒pHBM720DNA纯化后经CpoI和AscI双酶切后得到的大片段连接,连接产物转化大肠杆菌Xl_(10)-gold,得到正确的重组子命名为pHBM726。此质粒pH BM726,即为带有壮观霉素抗性基因(aadA)筛选标记的质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因油菜叶绿体单交换表达载体;在此载体中壮观霉素抗性基因(aadA)、乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因(ACC)和绿色荧光蛋白基因(gfp)共6个基因串联在一起,共用一个启动子序列,一起来进行表达;通过酶切检测、PCR验证和测序验证,均表明该表达载体构建成功。最后此载体在大肠杆菌中表达时,发现重组菌能够在含壮观霉素的培养基上生长,且在可见光下,能看到绿色荧光,表明壮观霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因均在大肠杆菌中成功表达;表达产物通过Western印迹验证表明组成乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因在大肠杆菌中成功表达。以上结果表明,该表达载体中串联排列的这6个基因均在大肠杆菌中成功表达。该研究结果可为质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转叶绿体的研究奠定基础,为油菜油脂代谢研究提供参考。     

水稻质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达研究

戊糖磷酸途径是高等植物中重要的代谢途径,主要生理功能是产生NADPH以及供核酸代谢的磷酸戊糖。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）是戊糖磷酸途径的关键酶,广泛存在于高等植物细胞的细胞质和质体中。木研究首次从水稻（Oryza sativa L.）幼苗中分离了核编码的质体G6PDH基因OsG6PDH2,序列分析表明OsG6PDH2编码一个具有588个氨基酸残基的多肽,等电点为8．5,分子量66kDa。OsG6PDH2的N端有1个70个氨基酸的信号肽,推测的裂解位点为Gly55和Val56,表明OsG6PDH2编码产物可能定位于质体。多序列比较的结果表明OsG6PDH2与拟南芥、烟草、马铃薯质体G6PDH的一致性分别达81％、87％、83％。进化关系说明水稻OsG6PDH2与拟南芥（AtG6PDH3）、马铃薯（StG6PDH1）处于高等植物P2型质体G6PDH分支上,暗示了OsG6PDH2可能是一个P2型的质体蛋白。Matinspector程序分析表明,OsG6PDH2在起始密码子上游含有一个bZIP转录因子识别位点、一个ABA应答元件、一个CRT／DRE元件和1个W-box元件。半定量RT-PCR分析表明,OsG6PDH2在水稻根、茎、叶和幼穗组织中都呈低丰度组成型表达,在根部表达较高,在水稻幼苗中的表达显著受暗处理的诱导。将OsG6PDH2的完整开放阅读框构建到大肠杆菌表达载体pET30a（＋）中,pET30a（＋）-OsG6PDH2在大肠杆菌中得到了有效表达。酶活性测定证明,OsG6PDH2的编码产物具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的功能。     

烟草质体分裂蛋白NtFtsZs在大肠杆菌中的定位分析

分别构建了两个烟草 (NicotianatabacumL .)质体分裂基因NtFtsZ1和NtFtsZ2与编码绿色荧光蛋白的gfpS65A、V68L、S72A基因相融合的原核表达载体 ,并导入大肠杆菌 (Escherichiacoli)JM10 9菌株中进行表达。全长NtFtsZs∶GFP融合蛋白在菌体中有规律地定位 ,暗示NtFtsZs能识别大肠杆菌潜在的分裂位点 ,并能与大肠杆菌的内源FtsZ发生聚合作用 ;融合蛋白的诱导表达抑制了宿主菌的分裂 ,形成了明显的丝状菌体 ,证明真核生物的ftsZ基因与大肠杆菌的ftsZ基因有相似的作用。同时构建了NtFtsZs不同缺失的原核表达载体 ,对这两个基因所编码蛋白不同结构域的功能做了初步分析。实验结果表明 ,烟草FtsZ蛋白的C端结构域与其在大肠杆菌细胞中的正确定位有关 ;而N端结构域与NtFtsZs∶GFP融合蛋白的聚合有关。     

玉竹雄配子的发育——着重阐明质体在生殖细胞和营养细胞中的分布和变化

玉竹(Polygonatum simizui Kitag)小孢子在分裂前,质体极性分布导致分裂后形成的生殖细胞不含质体,而营养细胞包含了小孢子中全部的质体。生殖细胞发育至成熟花粉时期,及在花粉管中分裂形成的两个精细胞中始终不含质体。虽然生殖细胞和精细胞中都存在线粒体,但细胞质中无DNA类核。玉竹雄性质体的遗传为单亲母本型。在雄配子体发育过程中,营养细胞中的质体发生明显的变化。在早期的营养细胞质中,造粉质体增殖和活跃地合成淀粉。后期,脂体增加而造粉质体消失。接近成熟时花粉富含油滴。对百合科的不同属植物质体被排除的机理及花粉中贮藏的淀粉与脂体的转变进行了讨论。     

油菜叶片及其脱分化和再分化中质体的电镜观察

我们用电镜观察了油菜叶片植株再生中质体的超微结构变化。在油菜叶肉细胞中,叶绿体的基粒,基质片层发育良好,偶尔有淀粉粒。在来自叶片的愈伤组织细胞中,质体体积变小,类囊体已经消失或部分消失,有的质体含有淀粉粒,但很少有质体小球。经培养分化后的愈伤组织,特别是在表层细胞中,质体数量急剧增多,形态变化很大,贮藏淀粉明显减少。基质内已有泡状或管状结构。有的质体已出现长的基质片层,但未见到基粒;质体中常有质体球。由此可见,质体是一个十分敏感的细胞器,它的变化与细胞分化有关,变化最大的部分是片层系统,贮藏淀粉,质体小球。片层系统中尤以基粒片层变化最为显著。     

分子遗传学术语解释(续)

降解质体(degradative plasmid) 指某些细菌质体控制一套异化酶系,把复杂的有机化合物转变为简单的代谢物,具有这种功能的质体称之为降解质体。在假单胞菌属(Pseudomonas)中已发现五种质体:1)、降樟脑质体(CAM plasmid);2)、解辛烷质体(OCT plasmid);3)、解水杨酸酯质体(SAL plasmid)。     

质体

质体是植物细胞特有的一类细胞器,藻类的质体类型比较单一,一般只有叶绿体一种,到了被子植物质体的类型才增多,而且被子植物细胞的发育,很大程度表现在质体的分化上。自从本世纪60年代确证质体含有自己的DNA以来,有人将质体看作是细胞内的细胞,这对理解质体有一定意义。在分生组织中质体呈未分化状态,叫做原质体。随着细胞的分化,原质体的结构和功能都发生深刻的变化,并形成各种质体。按照惠特利(Whatley 1978)的意见,质体大体可分