α1,3—岩藻糖基转移酶及其相关产物

α１,３┐岩藻糖基转移酶及其相关产物陈继华陈惠黎（上海医科大学卫生部糖复合物重点实验室,上海２０００３２）关键词α１,３－岩藻糖基转移酶Ｌｅｗｉｓ（Ｌｅ）系抗原细胞表面的糖蛋白或糖脂的一部分含有外链岩藻糖（Ｆｕｃｏｓｅ,Ｆｕｃ）化的乙酰乳糖胺糖链,常...     

人肝癌组织中a（1，3）FuT－Ⅲ，Ⅴ．Ⅵ基因表达的研究

人肝癌组织中ａ（１,３）ＦｕＴ－Ⅲ,Ⅴ．Ⅵ基因表达的研究／／范俊,谢天培,刘彦军,胡匀,顾天爵（上海医科大学基础医学院生化教研室,２０００３２;第二军医大学东方肝胆研究所,２００４３３）关键词ＰＣＲ;ａ（１,３）岩藻糖转移酶（ＦｕＴ）;人肝癌;原位杂...     

大鼠诱发肝癌过程中N乙酰氨基葡萄糖转移酶V的高效液相层析测定

提纯人血浆运铁蛋白,经链霉蛋白酶水解,再经肼解法制备Ｔｆ中的二天线Ｎ糖链,后者经还原末端的氨基吡啶化进行荧光标记,再切除外链的唾液酸和半乳糖残基,获得Ｇｎ２Ｍａｎ３Ｇｎ２－ＰＡ荧光标记糖链,以此制备的糖链为受体底物,ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ为供体底物,用反相ＨＰＬＣ分离底物和产物,建立了Ｎ乙酰氨基葡萄糖转移酶测定法,用ＧｎＴ－Ｖ作为肿瘤生化标志物,观察到在二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的过程中,此酶在诱癌第     

人胚肺成纤维细胞株纤连蛋白结构域N—糖链结构研究

本文应用明胶、肝素亲和层析二步法首先纯化了人胚肺成纤维细胞培养液的纤连蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ,Ｆｎ）,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定为一条带,然后用胰糜蛋白酶消化纯化的Ｆｎ所获得的酶解液,经分离分别得到明胶结合片段和肝素结合片段,再应用凝集素－ＨＲＰ染色的Ｗｅｓｔｅｒｎ转移电泳法研究糖链结构,结果证实：１．Ｆｎ中明胶结合片段（４４ｋｄ）中含有二天线和多天线复杂型糖链,并接有平分型ＧｌｃＮＡｃ糖基、核     

分化剂和增殖剂对肝癌细胞N－乙酰基葡萄糖转移酶的调节

用我室建立的ＨＰＬＣ法测定分化诱导剂,视黄酸（ＲＡ）和双丁酰环磷酸腺苷（ｄｂ－ｃＡＭＰ）,及增殖促进剂,佛波醇肉桂酸乙酸酯（ＰＭＡ）对ＳＭＭＣ－７７２１人肝癌细胞Ｎ－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ｖ和ＩＩＩ（ＧｎＴ－Ｖ,ＧｎＴ－ＩＩＩ）的影响,发现对照细胞在培养５天后ＧｎＴ－Ｖ略见升高。经ＲＡ和ｄｂ－ｃＡＭＰ处理后,可通天降低ＧｎＴ－Ｖ的活力,但不论对照或处理细胞均未测出ＧｎＴ－ＩＩＩ的活力。ＰＭＡ可增高ＧｎＴ－Ｖ和ＧｎＴ－ＩＩＩ的活力,对ＧｎＴ－ＩＩＩ的增加较ＧｕＴ－Ｖ发生较早亦较强。以上结果和我室报道的ＲＡ或ｄｂ－ｃＡＭＰ减少而ＰＭＡ增加ＳＭＭＣ－７７２１细胞表面Ｎ－糖链的天线数相符,也和大鼠化学诱发肝癌中ＧｎＴ－ＩＩＩ和Ｖ的增高相一致。     

人胚肺成纤维细胞株纤连蛋白结构域N─糖链结构研究

本文应用明胶、肝素亲和层析二步法首先纯化了人胚肺成纤维细胞培养液的纤连蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｏｔｈｅ,Ｆｎ）,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定为一条带,然后用胰糜蛋白酶消化纯化的Ｆｎ所获得的酶解波,经分离分别得到明胶结合片段和肝素结合片段,再应用凝集素－ＨＲＰ染色的Ｗｅｓｔｅｎ转移电泳法研究糖链结构,结果证实：１．Ｆｎ中明胶结合片段（４４ｋｄ）中含有二天线和多天线复杂型糖链,并接有平分型ｇｌｃＮＡｃ糖基、核心力Ｆｕｃ。２肝素结合片段（３０ｋｄ）只含有二天线复杂型糖链,不含平分型ＧｌｃＮＡｃ糖基及核心Ｆｕｃ．     

岩藻糖糖链与肝癌细胞的迁移作用

通过凝集素印迹转移电泳和亲和层析技术,对岩藻糖糖基化蛋白在肝癌细胞中的作用进行了研究.在化学诱发的大鼠肝癌过程中, 分子质量在23 ku到40 ku范围内与荆豆凝集素(UEA)及扁豆凝集素(LCA)结合的岩藻糖糖基化蛋白显著减少, 诱癌至17～20周这些条带重新恢复,而分子质量为80 ku的条带却在诱癌过程中逐周增加.比较高、低转移性肝癌细胞的岩藻糖糖基化蛋白, 发现高转移性肝癌细胞具有多种增强的条带.利用橘果粉胞凝集素(AAL)和LCA亲和层析柱分离了这些岩藻糖基化糖蛋白, 并用这些糖蛋白直接作用于肝癌细胞,发现AAL-糖蛋白具有显著抑制肝癌细胞迁移的作用,迁移细胞数从对照的(100±4.9)%下降到(48.1±2.5)% (P＜0.01), LCA-糖蛋白也有类似作用.用胰酶和木瓜蛋白酶水解蛋白质部分后,形成的糖肽抑制肝癌细胞迁移的作用并不改变,甚至增强.此外直接用肝癌转移灶的组织测定了岩藻糖转移酶活性,发现α1,6岩藻糖基转移酶活性显著比正常肝组织高,而α1,3岩藻糖基转移酶活性没有显著的改变.用系列凝集素分析发现这些糖链主要能结合伴刀豆凝集素A, 也能结合E-型及L-型植物凝集素, 显示这种糖蛋白的糖链可能含有较多的高甘露糖型.这些结果提示糖链在诱癌过程中结构有了改变,使之在肝癌细胞的迁移和转移中起重要作用.     

胸腺细胞表面岩藻糖化抗原在细胞凋亡过程中变化的初步研究

细胞表面糖在细胞分化及细胞周期中均有一定的变化,而且还与细胞间的识别与信息传递有关,为了解膜表面糖复合物在细胞凋亡过程中的作用,通过地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡为模型,利用对８种抗原结构相关的寡糖特异的单克隆抗体,观察凋亡过程中胸腺细胞表面岩藻糖化糖抗原结构的变化。免疫组化的分析结果表明：正常胸腺细胞表面的糖抗原主要是含有岩藻糖基的Ｈ－２和Ｌｅ￣ｂ．而凋亡的胸腺细胞表面出现ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌ－,Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌ－及双岩藻糖化抗原Ｌｅ￣Ｙ,同时Ｌｅ￣ｂ消失。磷脂提取结果表明在给药３ｈ后膜的ＰＳ条带明显增加,通过对诱发细胞凋亡过程中组化分析的时相变化观察发现：凋亡细胞膜表面糖抗原的变化在给药１ｈ（即凋亡发生前）就出现。以上结果说明凋亡过程中胸腺细胞表面岩藻糖化抗原发生了变化,且此变化可能与细胞凋亡的始发有关。     

人肝癌中Lewis抗原,α1,3岩藻糖转移酶与转移倾向

为了测定人原发性肝癌中Ｌｅｗｉｓ抗原和α１,３岩灌糖转移酶（ＦｕｃＴ）亚型的表达,及其与癌栓形成和转移抑制基因ｎｍ２３－Ｈ１表达的关系,用免疫组化法测Ｌｅｗｉｓ抗原,用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法测ＦｕｃＴ和ＮＭ２３－Ｈ１的ｍＲＮＡ。结果表明,肝癌组织中ＳＬｅ＾ｘ、Ｌｅ＾ｘ、ＳＤＬｅ＾ｘ、ＳＬｅ＾ａ４和Ｌｅｗｉｓ抗原表达的 率均在８０％左右。其中ＳＬｅ＾ｘ表达较多,Ｌｅ＾ｘ和ＳＬｅ＾ａ较少,ＳＤＬｅ＾ｘ     

蛋白激酶C对N－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ的调节

人肝癌细胞株７７２１细胞的Ｎ－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ（ＧｎＴⅢ）活性受Ｓｅｒ／Ｔｈｒ蛋白激酶的两种抑制剂ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ和三氟吡嗪（ＴＦＰ）．蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）的两种特异性抑制剂Ｄ－鞘氨醇和ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ的抑制。用ＰＭＡ处理细胞舌,ＧｎＴⅢ活力随膜性ＰＫＣ（ｍ－ＰＫＣ）活力而平行变化,但与胞液ＰＫＣ活力的变化无关。Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、Ｄ－鞘氨醇和ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ还能够阻断ＰＭＡ对ＧｎＴⅢ的激活。Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ对ｍ－ＰＫＣ和ＧｎＴⅢ的抑制作用基本上与它们的应用浓度成正比关系。当人及大鼠肾脏的粗ＧｎＴ制剂分别用碱性磷酸酶切除磷酸基后,ＧＤＴⅢ的活力明显下降。这些结果表明ｍ－ＰＫＣ可能通过蛋白质的Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基上磷酸化和去磷酸化作用直接或间接地调节ＧｎＴⅢ。     

慈菇（Sagittaria safittifolia）α－半乳糖苷酶的纯化与性质

以对硝基苯糖苷基为底物,测定了慈菇的１２种糖苷酶,其中α－甘露糖苷酶、α－和β－半乳糖苷酶活力较高;经硫酸铵分级沉淀,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０分子筛层析,ＣｏｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ离子交换层析,从慈菇抽提液纯化了α－半乳糖苷酶。纯化酶的比活提高１０７２倍,活力回收１５．６％,在圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上均显示１条蛋白质带,在α－半乳糖苷酶浓度为１５０ｍＵ／ｍｌ的溶液中测不到其他糖苷酶的活力。慈菇α－半乳糖苷酶的分子量用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤柱测定或在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上测定均为６０ｋＤ,酶反应的最适ｐＨ在５．８附近,最适温度为６０℃。该酶分解对硝基苯基－α－半乳糖苷的Ｋ＿ｍ值为３．７×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ,Ｖ＿ｍ值为２．１×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ。银离子、汞离子显著抑制酶活力,Ｄ－半乳糖和密二糖均竞争性地抑制该酶水解对硝基苯基α－Ｄ－半乳糖苷的活力,根据Ｄｉｘｏｎ作图求得其Ｋ＿ｉ值分别为０．９２×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ和１．９８×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ。２－脱氧－Ｄ－半乳糖和Ｌ－岩藻糖为酶活力的非竞争性抑制剂。化学修饰     

双链杂交分子“胰岛素－类胰岛素生长因子－I

以去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素（ＤＯＩ）和化学合成的ＩＧＦ－Ｉ的２２～２９（８肽）及２２－３２（１１肽）为底物,用酶促半合成方法制备了杂交分子“胰岛素－类胰岛素生长因子－Ｉ,Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ（８）和Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ（１１）。研究了它们的胰岛素生物活性,结果表明,猪胰岛素Ｂ链Ｃ端Ｂ２７的Ｔｈｒ被Ａｓｎ取代,Ｂ３０的Ａｌａ被Ｔｈｒ取代同时Ｂ２５～Ｂ２６及Ｂ２８－Ｂ２ｋ９氨基酸顺序颠倒以及在Ｂ链Ｃ末端延长３肽（Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ）都不影响胰岛素的生物活力。     

核糖体RNA拓扑学与RNAN－糖苷酶研究进展（下）

２８ＳｒＲＮＡ的α－ｓａｒｃｉｎ结构域直接参与核糖体催化的蛋白质合成反应,已经证明天花粉蛋白是一种ＲＮＡＮ－糖苷酶,一种测定ＲＮＡＮ－糖苷酶活力的新方法也已初步建立。天花粉蛋白能使超螺旋ＤＮＡ解旋并断裂为缺口环状和线状ＤＮＡ．并已发现其它ＲＮＡＮ－糖苷酶也具有这一核酸内切活性。天花粉蛋白对２８ＳｒＲＮＡ,超螺旋ＤＮＡ和艾滋病毒（ＨＩＶ－１）ＲＮＡ三种底物可能有相同的分子作用机制．     

N－糖链在纤连蛋白分泌及纤连蛋白受体与配体结合中的作用

应用能阻断糖蛋白Ｎ－糖链合成的衣霉素（ＴＭ）,研究了Ｎ－糖链缺失对ＨＴ１０８０细胞分泌纤连蛋白（Ｆｎ）以及纤连蛋白受体（ＦｎＲ）与配体结合的影响。结果发现,１μｇ／ｍｌ的ＴＭ可抑制Ｎ－糖链的合成（此时,３Ｈ－甘露糖掺入下降６３％）,但细胞分泌Ｆｎ的量仅下降３３％,这主要是由于蛋白合成受ＴＭ抑制（２５％）而引起,因而,Ｎ－糖链缺失可能并不影响Ｆｎ的分泌。而在同样条件下,单个细胞结合１２５Ｉ－Ｆｎ的量显著下降,显示Ｎ－糖链的缺失可能导致了膜上ＦｎＲ总量或其与配体结合的亲和力的改变。ＴＭ处理组的ＦｎＲ的内吞率与对照组相比较无明显差异,提示受体分子中的Ｎ－糖链缺失不影响其内吞过程．     

大豆液泡膜H~+-ATPase泵质子活性的研究

研究了大豆液泡膜Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ泵质子特性。液泡膜Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ泵质子活性受ＮＥＭ、ＮＢＤ－Ｃｌ、ＤＣＣＤ和ＮＯ３－的抑制。泵质子活性由二价阳离子启动,其有效性依次为Ｆｅ２＋＞Ｍｇ２＋＞Ｍｎ２＋,它以ＡＴＰ为最适底物,ＡＤＰ为竞争性抑制剂;最适ｐＨ为７．０,最适温度为５０°Ｃ。     

CCK－8和NDAP对大鼠脑和脊髓组织c－fos表达的影响

为探讨八肽胆囊收缩素（ＣＣｋ－８）和阿片肽相互作用的分子机理,利用抗体免疫沉淀技术研究了ＣＣＫ－８与ＮＤＡＰ（ｋ阿片受体激动剂）对大鼠脑（去皮层和小脑）和脊髓背柱组织Ｆｏｓ蛋白的影响。结果表明,０．１μｍｏｌ／ＬＣＣＫ－８可显著刺激脑和脊髓组织中Ｆｏｓ蛋白增加（分别是对照组的３．８倍和３．６倍）。相同浓度的ＮＤＡＰ对Ｆｏｓ蛋白的生成亦有一定的诱导作用,分别是对照组的２．７倍和２．６倍。ＣＣＫ－８和ＮＤＡＰ共同处理组织,Ｆｏｓ蛋白生成水平相似（脑）或高于（脊髓）ＣＣＫ~－８单独诱导的水平。结果表明,ＣＣＫ－８和ＮＤＡＰ均可直接诱导大鼠脑和脊髓组织ｃ－ｆｏｓ的表达,它们对ｃ－ｆｏｓ表达的相互作用在脑和脊髓中呈现不同的模式。     

系统感染TMV的番茄叶片胞外四种β－N－乙酰氨基己糖苷酶的纯化和性质

系统感染ＴＭＶ的番茄叶胞外提取液经冰冻干燥浓缩、－２０℃丙酮沉淀、离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化,获得４种β－Ｎ－乙酰氨基己糖苷酶。这些酶是由７５ｋＤ亚基构成的电荷异构体（ｃｈａｒｇｅｉｓｏｍｅｒ）,用过碘酸－Ｓｃｈｉｆｆ反应证明是糖蛋白,以Ｄ－硝基苯－Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基葡萄糖苷（ｐＮＰ－β－Ｄ－ＧｌｃＮＡｃ）和ｐ－硝基苯－Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基半乳糖苷（ｐＮＰ－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ）为底物,这些酶具有相似的性质。Ｎ－乙酸氨基葡萄糖（ＧｌｃＮＡｃ）和Ｎ－乙酰氨基半乳糖（ＧａｌＮＡｃ）是这些酶的竞争性抑制剂,Ａｇ＋和Ｈｇ２＋是它们的强抑制剂,Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋和Ｃｕ２＋也抑制其活性。     

细胞生长和表面精蛋白的N－糖链中核心岩藻糖的关系

细胞生长和表面精蛋白的Ｎ－糖链中核心岩藻糖的关系董素才,杨小平,陈惠黎（上海医科大学生物化学教研室,２０００３２）关键词精蛋白Ｎ—糖链,核心岩藻糖,小扁豆凝集素,细胞生长细胞表面精蛋白Ｎ一糖链的结构与细胞生长、分化、恶变有密切关系,除糖链的类型和天线...     

双链杂交分子“胰岛素—类胰岛素生长因子—I”

以去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素和化学合成的ＩＧＦ－Ｉ的２２－２９及２２－３２为底物,用酶促半合成方法制备了杂交分子“胰岛素－类胰岛素茵子－Ｉ”,Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ和Ｉｎｓ－ＩＧＦ－Ｉ。研究了它们的胰岛中生物活性。结果表明,猪胰岛素Ｂ链Ｃ端Ｂ２７的Ｔｈｒ被Ａｓｎ取代,Ｂ３０的Ａｌａ被Ａｌａ被Ｔｈｒ取代同时Ｂ２５－Ｂ２６及Ｂ２８－Ｂ２９氨基酸顺序颠紧及在Ｂ链Ｃ末端延长３肽都不影响胰岛素的生物活力。     

胸腺细胞表面岩藻糖化抗原在细胞凋亡过程中变化的初步研究

细胞表面糖在细胞分化及细胞周期中均有一定的变化,而且还与细胞间的识别与信息传递有关,为了解膜表面糖复合物在细胞凋亡过程中的作用,通过地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡的模型,利用对８种抗原结构相关的寡糖特异的单克隆抗体,观察凋亡过程中胸腺细胞表面岩菏糖化糖抗原结构的变化,免疫组化的分析结果表明,正常胸腺细胞表面的糖抗原主要是含有岩藻糖基的Ｈ－２和Ｌｅ＾ｂ,而凋亡的胸腺细胞表面出现ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａ