应用real-timePCR法快速定量人类粪便中双歧杆菌的研究

目的建立快速、准确从粪便标本中定量双歧杆菌的RT—PCR技术。方法传统培养定量法,普通PCR定量法,real—timePCR比较测量。结果（I）粪便标本前处理采取简单的离心和清洗、稀释步骤能去除粪便标本中的抑制物,实现不提取DNA直接进行PCR、real—time定量粪便中双歧杆菌。（2）本实验建立的PCR方法直接半定量粪便双歧杆菌技术在双歧杆菌值介于10^3～10^7CFU／ml时具有较好的分辨率,粪便标本普通PCR得理论菌数与培养得菌数值之间差异无显著性（P〉0．05）;real-timePCR直接定量双歧杆菌技术在双歧杆菌值介于10^1-10^7CFU／ml时具有较好的分辨率,粪便标本RT—PCR得理论菌数与培养得菌数值之间差异无显著性（P〉0．05）。结论利用PCR、real—timePCR直接半定量和定量粪便中的双歧杆菌可行。     

东洞庭湖地区野禽驯养繁殖基地的禽流感病毒调查

为了解东洞庭湖地区野禽驯养繁殖基地禽流感病毒感染状况,2011年11月至2013年10月,调查4家野禽驯养繁殖基地的养殖情况,同时采集环境标本(包括新鲜粪便标本和水标本)。利用PCR和病毒分离方法对标本进行检测。部分标本进行了核酸检测,禽流感病毒(AIV)阳性率为36.62%,2012年3月份阳性率最高(47.83%)。粪便标本、水标本的AIV阳性率分别为40.45%、30.19%,二者无统计学差异。共分离到28株AIV病毒,亚型包括H10、H4、H5和N7、N8,集中于11~12月的标本,主要来源于君山区野禽驯养繁殖基地的雁类和野鸭的新鲜粪便标本。野禽驯养基地的环境标本中存在AIV病毒,以A(H10N7)为主,建议对其进行定期监测。     

腹型过敏性紫癜患儿急性期与恢复期肠道菌群变化的分析

目的探究腹型过敏性紫癜患儿急性期与恢复期肠道菌群的变化,为制定更针对性的过敏性紫癜治疗措施提供依据。方法选取28例腹型过敏性紫癜患儿粪便标本(急性期19例和恢复期9例),9例非腹型过敏性紫癜患儿粪便标本,一共37例粪便标本。采用Illumina MiSeq平台提取样本DNA进行高通量测序,对测序结果进行生物信息学分析。结果腹型过敏性紫癜患儿急性期肠道菌群α多样性与恢复期、非腹型过敏性紫癜存在显著差异,而β多样性没有显著差异,腹型过敏性紫癜患儿急性期粪便标本中韦荣球菌属的相对丰度显著高于无腹痛腹型过敏性紫癜和非腹型过敏性紫癜患儿,而瘤胃球菌属的相对丰度在腹型过敏性紫癜患儿恢复期粪便标本中最高。结论肠道菌群的变化可能参与腹型过敏性紫癜的发病,其中主要表现在急性期韦荣球菌属丰富度的增加和恢复期瘤胃球菌属丰富度的升高,为微生物制剂的应用提供依据。     

人类肠道菌群DNA提取影响因素的研究

目的研究提取人类粪便中细菌基因组DNA的影响因素。方法采用溶菌酶和十二烷基磺酸钠(SDS)+石英砂+酚-氯仿抽提法提取粪便标本中细菌DNA,用PCR扩增细菌16SrDNA。比较不同粪便量,不同放置时间,不同放置温度下的粪便细菌DNA浓度及纯度改变;用Chao index评测高通量测序的结果。结果采用20mg粪便量提取出的细菌DNA的浓度最高;常温下放置3h后,提取的细菌DNA的浓度开始下降;在-20℃放置12h后,细菌DNA的浓度开始下降;-70℃放置48h后细菌DNA的浓度开始下降;样品纯度均在1.8以上;Chao index曲线趋于平缓表明测序数据量足够大。结论提取肠道细菌基因组DNA时,粪便标本取样量以20mg为宜,常温下粪便标本放置不超过2h,本研究所使用的方法所提取的DNA浓度可以达到高通量测序的样本要求。     

3种粪便标本保存方法对肠道菌群检测结果影响的比较研究

比较3种粪便标本保存方法对肠道菌群检测结果的影响,为采集粪便标本后短期保存方法的选择提供参考。收集10名志愿者的新鲜粪便标本,对每份标本分别采用4℃、室温(25℃)、无水乙醇保存4 h,然后统一放入-80℃低温冰箱冻存。随后进行细菌DNA提取,并对16S rRNA V4区基因进行扩增,应用Illumina MiSeq平台进行高通量测序,比较3种保存方法下肠道菌群多样性和组成差异。结果表明,3种保存方法下,肠道菌群在Alpha多样性方面无统计学差异(P0.05)。肠道菌群属水平比较,毛螺旋菌属(Lachnospira)在无水乙醇组中相对丰度高于4℃组和室温组(P0.05),萨特菌属(Sutterella)在无水乙醇组中相对丰度高于4℃组(P0.05),而真杆菌属(Eubacterium)在无水乙醇组中相对丰度低于室温组(P0.05)。PCoA分析发现,当UniFrac距离加权后,4℃和无水乙醇保存同一受试者粪便标本,菌群结果较为接近,而室温保存会导致个别受试者菌群出现离散现象。无水乙醇短期保存粪便标本,肠道菌群多样性、组成以及结构保持稳定,能满足不同研究的需要。此外,无水乙醇具备价格低廉、便于携带等优点。因此,在新鲜粪便标本不能立即低温冻存时,无水乙醇保存可以作为首要选择。     

深圳地区环境水体和人群中诺如病毒监测与分析

【目的】检测深圳地区环境水体和人群的诺如病毒(No Vs),探讨其是否在两者之间循环传播。【方法】2014年3月至2015年2月检测24份深圳茅洲河河水标本和287份腹泻患者粪便标本。河水标本经过混合纤维素酯膜和PEG法二次浓缩后提取核酸,粪便标本无需浓缩,稀释离心后直接提取核酸。应用实时荧光逆转录PCR初步分型,RT-PCR扩增ORF2保守区域衣壳蛋白(VP1)基因后测序确定亚型、分析不同来源病毒的同源性;同时建立基因进化树,进一步分析不同来源No Vs的亲缘关系。【结果】在河水标本和腹泻患者粪便标本中,No Vs阳性率分别为23.1%和17.4%,其中上下游河水标本阳性率分别为8.3%和41.7%,河水中No VGI型和No VGII型的阳性率为16.7%和8.3%。扩增阳性样本发现茅洲河水中检出No V主要是GI.6型,其次是GII.4 Sydney_2012型,而从腹泻胃肠炎患者粪便标本中检出No Vs主要是No VGII.4Sydney_2012型和少量的GII.3型。同时期水体和人群粪便标本来源的No VGII.4 Sydney_2012型VP1基因相似性98.2%–100.0%。【结论】No VGII.4 Sydney_2012型是深圳地区主要的流行株。No Vs在环境水体和人群中于某种程度上存在循环传播。     

1 330例粪便标本培养的细菌分布及药敏结果

粪便标本的细菌培养检查是诊断肠道细菌感染性疾病的重要方法。依据药物敏感性试验结果 ,可以正确指导临床合理用药 ,预防滥用抗生素 ,减少耐药菌株的产生。我们对我院近 3年的粪便标本细菌培养和药敏结果作了回顾性统计分析 ,现报告如下。1　材料与方法1 1　标本来源　 1330例粪便标本均取 1999年 1月至 2 0 0 1年 12月我院住院及门诊病人。1 2　试剂和材料　ＳＳ琼脂、碱性胆盐琼脂 ,由杭州天和微生物试剂有限公司生产。ＷＣＧ无血培养基 ,中国药品生物制品所生产。以上培养基均按说明书配制使用。细菌鉴定和药敏试验用试剂、纸片等购于杭…     

住院腹泻患者艰难梭菌快速检测结果分析

目的了解住院腹泻患者艰难梭菌带菌情况,为抗生素相关腹泻患者的诊断和治疗提供参考。方法收集2015年9月至2016年8月住院腹泻患者粪便标本163份,用艰难梭菌快速检测试剂盒检测艰难梭菌。结果艰难梭菌检出总阳性率为20.86%(34/163),其中春季16.67%、夏季15.79%、秋季17.86%、冬季27.87%,经比较差异无统计学意义(χ2=2.943,P0.05);成人粪便标本阳性率为22.52%(25/111),儿童粪便标本阳性率为17.31%(9/52),差异无统计学意义(χ2=0.583,P0.05);男性粪便标本阳性率为21.69%(18/83),女性粪便标本阳性率为20.0%(16/80),差异无统计学意义(χ2=0.202,P0.05);艰难梭菌阳性患者抗菌药物平均使用天数为12.74d,阴性患者为8.21d,差异有统计学意义(t=-7.81,P0.01)。结论住院腹泻患者艰难梭菌阳性率高低与抗菌药物使用时间长短有关。     

O1群霍乱弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的:建立针对O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,并进行模拟粪便标本的检测评价。方法:根据O1群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度及特异性评价;将O1群霍乱弧菌灭活菌株悬液倍比稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成模拟带菌者粪便标本,提取DNA,进行Taq-Man PCR检测,用以评价该方法。结果:建立了快速检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR方法,灵敏度为每反应体系104拷贝;该方法对其他14种肠道菌DNA没有扩增;该方法对模拟粪便标本的检测灵敏度为每反应体系102 CFU。结论:建立了一种快速、高效检测O1群霍乱弧菌的荧光定量PCR检测方法,该方法可用于O1群霍乱弧菌临床粪便标本的检测。     

梭状芽胞杆菌与溃疡性结肠炎

<正> 顽固性梭状芽胞杆菌与溃疡性结肠炎的复发有关,但是该菌在溃疡性结肠炎的诊断与治疗中的作用方面,尚存在争论。作者对77例复发的溃疡性结肠炎患者中,62例在入院治疗前,12小时内留粪便。1例经抗生素治疗后发生典型的假膜性结肠炎患者给以除外。4例在症状发作前仅用抗生素治疗,35例服用柳氮磺胺吡啶。抗生素治疗后,1例患者粪便培养为阳性,但毒素为阴性,其它未经抗生素治疗的患者可发现毒素,但粪便培养为阴性。6例开始未留粪便标本,而在治疗过程中本菌培养为阴性。在治疗过程中,对25例患者的57份粪便标本进行检查,     

心脏手术后视幻觉发生与肠道菌群变化的研究

目的探究心脏术后患者视幻觉症状发生情况及体内肠道菌群变化。方法选取2020年1月-2021年1月中国科学院大学宁波华美医院接受择期体外循环心脏手术的成年患者21例作为研究对象。分别在术前、术后第1次或第2次排便、术后6～8 d进行微生物分析和粪便短链脂肪酸(SCFAs)浓度测定。采用实时荧光定量PCR法检测肠道菌群组成,高效液相色谱检测SCFAs。术后1周进行视幻觉评价。结果21例患者中,视幻觉3例。与术前相比,术后第1和第2份粪便样本的微生物总数显著降低(P<0.05)。在专性厌氧菌中,第一次术后粪便样本中的球形梭菌数量、柔嫩梭菌数量显著低于术前样本。兼性厌氧菌中,术后第1次和第2次标本的乳酸杆菌总数均显著降低。植物乳杆菌数量在第1次术后粪便样本中较低。L. sakei数量在第2次术后标本中明显下降。术后第1次粪便样本中肠杆菌科的数量明显高于术前样本。与术前相比,术后第1次粪便样本中的肠球菌数量显著升高。术后第2次粪便标本中葡萄球菌数量明显高于术前标本。术后视幻觉组葡萄球菌数量明显高于非视幻觉组,第2次术后粪便样本中术后视幻觉组葡萄球菌数量也明显高于非幻视觉组。视幻觉组的假单胞菌数量明显高于非视幻觉组和术后第2次粪便样本。术后第1次粪便标本中,视幻觉组肠杆菌数量高于非视幻觉组。视幻觉组术后第一次粪便样本中总SCFAs浓度显著低于非视幻觉组。以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论心脏手术后视幻觉的发生与肠道菌群变化存在一定联系,表现为肠道内肠杆菌科和肠球菌属数量增多,乳杆菌数量降低,同时还伴随着SCFAs浓度的降低。     

人粪便中枸橼酸杆菌菌种分布特点

枸橼酸杆菌属 (Citrobacter )细菌又称柠檬酸杆菌 ,是人体及动物粪便中的正常菌群之一 ,也是水体污染的重要细菌学指标之一。近年来 ,由于分子细菌学的发展 ,枸橼酸杆菌属细菌由原来的 3个种进一步分类到目前 11个种。粪便作为枸橼酸杆菌的重要贮菌场所 ,对其中的菌种分布了解可增加我们对枸橼酸杆菌的认识。为此 ,我们对部分住院病人和食堂体检人员的粪便中枸橼酸杆菌进行生理生化分类鉴定 ,结果报告如下。1　材料与方法1.1　材料　粪便为随机选择的住院病人和食堂体检人员送检标本 ,共 2 6 1份。1.2　方法　将标本接种 S.S平板 ,35℃过…     

2010年夏季急性细菌感染性腹泻患儿沙门菌感染分析

本文旨在了解急性细菌感染性腹泻患儿中沙门菌的感染现状及其耐药性.采集2010年7月1日~2010年9月30日复旦大学附属儿科医院门诊及住院急性细菌感染性腹泻患儿的粪便标本,进行沙门菌分离、培养及鉴定,采用Kirby-Bauer法进行药敏试验.共收集急性细菌感染性腹泻患儿粪便标本 1 045份,检出沙门菌 160株,阳性...     

免疫沉析法检测大肠埃希菌O157: H7抗原

本文作者采用一种免疫沉析法--Meridian IC-STAT法,对两组粪便标本作了大肠埃希菌(大肠杆菌)O157:H7抗原直接检测及从粪便肉汤培养中检测抗原,并与山梨醇麦康凯琼脂平板(SMAC)粪便培养法进行了比较.     

粪便中肠球菌SYBR GreenI荧光定量PCR检测方法的建立

目的利用SYBR GreenI荧光定量PCR方法,建立肠球菌实时荧光PCR检测方法,并初步应用于粪便中肠球菌的检测。方法根据GenBank发表的肠球菌23S rRNA基因序列的保守区域设计合成特异性的引物;利用构建的质粒标准品绘制两种标准曲线,构建基因拷贝数、细菌数为分析指标的定量分析模型并初步应用于粪便标本的检测分析。结果所建立的SYBR GreenI荧光定量PCR方法检测灵敏度可达7个拷贝数/reaction。粪便样本根据实时荧光定量PCR方法所得的理论数值与培养菌值之间差异无显著性(P>0.05)。非炎性腹泻标本中菌数与健康成人标本中菌数差异无显著性(P>0.05)。灵敏度曲线所得的数值大于菌数标准曲线,可能由于DNA提取过程中存在部分的损失。检测粪便标本结果显示SYBR GreenI荧光定量PCR方法较平板计数法敏感、快捷、简便。结论本研究建立了一种灵敏、特异、简便易行的肠球菌定量检测方法。     

关于重庆地区在治疗后的“新冠”病人粪便中发现2019新型冠状病毒核酸阳性的病例报告

2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)引起的肺炎(以下简称"新冠"),已经迅速席卷全国并传播到全球20多个国家。目前确诊依据为患者呼吸道标本中2019-nCoV核酸检测结果阳性;而患者症状消失,且间隔24 h连续2次呼吸道标本2019-nCoV核酸检测阴性为出院标准。作者对近期重庆市某医院收治的27例新冠病人的呼吸道及粪便标本采用RT-PCR方法进行连续多次2019-nCoV核酸检测。结果显示,6例患者粪便标本2019-nCoV核酸检测呈阳性,其中有2例呼吸道标本2019-nCoV核酸未检出,提示标本类型影响核酸检测的阳性率。综上所述,新冠病人不同类型的标本核酸检测结果一致性有差别,还需要开展更多更深入的研究以揭示该疾病在不同进程阶段核酸检测结果的规律。     

肝硬化患者无菌腹水中真菌DNA的检测及易位研究

目的检测和分析肝硬化患者无菌腹水中真菌DNA存在状况。方法选取118例无菌腹水的肝硬化患者为研究对象,分别采集患者刚入院时的腹水、血液和粪便标本。应用PCR技术直接检测标本的真菌DNA并克隆测序。并收集患者临床资料,对患者临床症状及检验结果进行分析比较。结果1名患者的腹水、血液、粪便中同时检测到真菌DNA,14名患者的腹水和粪便中同时检测到真菌DNA,3名患者的血液和粪便中同时检测到真菌DNA,大部分序列间的相似性高于99％。测序检测到最多的菌种为Candidaalbicans。结论肝硬化患者无菌腹水中能够检测到真菌DNA,并且提示在肝硬化患者腹水和血清中检测到的真菌DNA易位于肠道。     

小圆形病毒样因子引起新生儿急性胃肠炎的研究

33例新生儿急性胃肠炎的粪便标本经EM检测,12份(36.4％)粪便标本中检出了病毒样颗粒,其中11份(33,3％)为SRV样因子(SRV),1份为其他病毒样颗粒。经粪便包埋超薄切片和IEM证实SRV是引起新生儿急性胃肠炎的病原。SRV的直径为26nm,表面结构清晰。在氯化铯(CsCl)中的浮密度为1.36—1.40g/cm~3。应用微量CF试验,5例双份血清中的1例抗体有三倍升高,3例恢复期皿清抗补体,1例为阴性,该病人为其他病毒样颗粒感染。核酸电泳未显带。培养未见细胞病变。5例正常对照新生儿粪便未检出任何病毒样颗粒。     

老年慢性阻塞性肺疾病患者肺部感染病原菌与肠道定植菌的关系

目的探讨老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺部感染病原菌与肠道定植菌的关系,为后续研究提供参考。方法选择2018年7月至2019年7月我院呼吸内科收治的60例COPD患者作为研究对象,根据是否合并肺部感染将患者分为感染组(n=38)和未感染组(n=22)。收集患者痰和粪便标本进行细菌培养,比较两组患者痰和粪便细菌检出情况,并对痰培养及粪便培养结果进行直线相关回归分析。结果感染组患者痰标本中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌及大肠埃希菌检出率高于未感染组(均P0.05)。感染组患者粪便标本中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌检出率高于未感染组,肺炎链球菌检出率低于未感染组(均P0.05)。感染组患者粪便中各细菌检出率与痰培养细菌检出率呈正相关(r=0.745,P=0.009)。未感染组患者粪便中各细菌检出率与痰培养细菌检出率无显著相关性。结论老年COPD合并肺部感染患者病原菌与肠道定植菌具有一定相关性,临床治疗中应重视COPD患者肠道微生态平衡以降低肺部感染发生率。