血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建

目的：构建含有不同片段血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的启动子的萤光素酶报告基因载体,并定位缺氧诱导因子1a（HIF-1d）结合VEGF启动子的区域。方法：以VEGF全长启动子为模板,PCR扩增VEGF启动子的不同片段,插入萤光素酶报告基因载体pGL4-basic,确定所扩增的DNA序列后,将其与HIF-1a表达载体共转染293T细胞,定位HIF-1a结合VEGF启动子的区域。结果：测序结果表明扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;萤光素酶活性实验表明,-1128～-728bp片段是HIF-1a与VEGF相互作用激活VEGF启动子转录活性的区域。结论：克隆了VEGF启动子5’端缺失突变体报告基因表达载体,为调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究打下了良好基础。     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因, 研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区, 并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后, RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA, 然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497— –688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录, 即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。     

合浦珠母贝SOX9对Prismalin-14基因的调控研究

目的:研究合浦珠母贝转录因子SOX9对Prismalin-14的转录调控机制。方法:应用在线预测软件PROMO分析Prismalin-14的启动子序列,以预测Prismalin-14启动子上可能的转录因子与其结合位点;运用细胞共转染实验和双荧光素酶报告系统以检测SOX9对Prismalin-14启动子的激活作用;构建Prismalin-14启动子截短体的荧光素酶报告载体,并和SOX9的真核载体共转到HEK-293T细胞中,再进行双荧光素酶报告系统检测Prismalin-14启动子的活性;构建SOX9截短体的真核表达载体,并与Prismalin-14启动子的荧光素酶报告载体共转到HEK-293T细胞中,再进行双荧光素酶报告分析Prismalin-14启动子的活性。结果:SOX9能激活Prismalin-14的启动子的活性,并具有剂量效应;对Prismalin-14启动子进行截短后,不包含结合位点的Prismalin-14启动子的活性是野生型Prismalin-14启动子活性的49%,推测Prismalin-14启动子上的-415bp到-405bp区域是SOX9激活作用的关键区域;对SOX9的SRY-related HMG结构域进行截短后,其对Prismalin-14启动子的激活作用显著减少,因此SOX9结构的完整对Prismalin-14启动子活性的激活作用是必须的。结论:Prismalin-14的转录可能受SOX9调控,为进一步研究合浦珠母贝的转录调控机制提供基础,将有助于从分子水平上理解贝壳形成的上游调控机理。