酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因启动子的分离和鉴定

用启动子探针型载体pFR109从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)总DNA中克隆到多个启动子片段,它们在大肠杆菌中均能启动β-半乳糖苷酶基因的表达。对其中Y8片段的进一步分析结果表明:该片段不仅来自酿酒酵母基因组,而且是以多拷贝的形式存在。当Y8片段再次转入供体酵母时,它仍能启动β-半乳糖苷酶基因表达,但经次克隆去掉Y8片段5′端部分顺序后,它就失去了启动子的功能。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisisae) 基因启动子的分离和鉴定

用启动子探针型载体pFR109从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisisae)总DNA中克隆到多个启动子片段,它们在大肠杆菌中均能启动β-半乳糖萤酶基因的表达。对其中Y8片段的进一步分析结果表明：该片段不仅来自酿酒酵母基因组,而且是以多拷贝的形式存在。当Y8片段再次转入供体酵母时,它仍能启动β-半乳糖苷酶基因表达,但经次克隆去掉Y8片段5’端部分顺序后,它就失去了启动子的功能。     

β—半乳糖苷酶基因在猕猴桃果实成熟过程的表达

从成熟中华猕猴桃果实中克隆以了一个β－半乳糖苷酶基因ｃＤＮＡ片段,其长度为７４７ｂｐ,有一由２４９个氨基酸组成的开放阅读框架它与苹果、 芦笋、绿药椰菜、番匣中β－半乳糖苷酶基因ｃＤＮＡ相应区段的的核同源性为７６．３％～７０．３％,氨基酸同源性为６９．１％～７２．７％,用该片段为探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析表明,果实采收时,β－半乳糖苷酶ｍＲＮＡ水平最高,随后呈下降变化,同时β－半乳糖苷酶ｍＲＮＡ水     

家蚕丝蛋白基因启动子调控β－半乳糖苷酶在家蚕细胞系中的瞬时表达

家蚕丝蛋白基因启动子调控β－半乳糖苷酶在家蚕细胞系中的瞬时表达华刚,钱斌,吴祥甫（中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）关键词丝蛋白启动子;β－半乳糖苷酶基因;瞬时表达家蚕丝蛋自基因（Ｗｂ：Ｆｉｂｒｏｉｎｇｅｎｅ）在发育后期幼虫的后部丝腹中主要...     

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子ＧＡＬ１的穿梭表达质粒ｐＹＥＳ２中,并把得以的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失９０％以上的ｐｅｐ４－３突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β－半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β－半乳糖苷酶少水平不仅均要高于另一对照菌株,并且ｐｅｐ４－３突变菌株表现受葡萄糖阻遏的严紧程     

人乳头瘤病毒6b型H增强子样序列在大肠杆菌中增强基因转录和β-干扰素表达

将人乳头瘤病毒６ｂ型（ＨＰＶ６ｂ）基因组上游调控区（ＵＲＲ）５４０ｂｐ的Ｓａｕ３Ａ－ＮａｒＩ片段（Ｈ序列）,正反向插入β－干扰素表达载体Ｔｒｐ启动子上游,使β－ＩＦＮ表达明显增强,可使基因表达水平提高３．６倍（正向）和２．１倍（反向）。Ｈ序列正反向插入增强子检测载体不仅使β－半乳糖苷酶表达活性增加５－１０倍,还能使半乳糖苷酶ｍＲＮＡ量明显增高,证明Ｈ序列对被调控基因的增强作用是发生在转录水平。     

原核增强子样序列的研究

本文采用启动子检测载体和增强子检测载体发现来自大肠杆菌JMl03 DNA的一个1．0kb左右的片段能在痘苗病毒启动子上游增强细菌CAT和β－半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,这种增强效应无明显的方向性,一般可使基因表达水平提高3～6倍,此原核增强子样序列同时也具有启动子功能。此外还测定了增强片段的部分DNA序列。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

Kl LAC4用作白色念珠菌的报告基因

由于ｌａｃＺ基因在白色念珠菌中不能工作。将克氏酵母的β－半乳糖苷酶基因Ｋｌ ＬＡＣ４构建了能在白色念珠菌中工作的报告基因。Ｋｌ ＬＡＣ４基因融合到白色念珠菌乙醇脱氢酶基因（ＡＤＨ１）的启动子后面,在ＡＤＨ１终止子的共同控制下构建Ｋｌ ＬＡＣ４的表达质粒ｐＹＰＢ１－ＬＡＣ４。ＰＹＯＢ１－ＬＡＣ４转化白色念珠菌并测定了在固体培养基中的β－半乳糖苷酶活性以及在液体增减基的β－半乳糖苷酶活力。结果表明Ｋｌ     

β-半乳糖苷酶基因在猕猴桃果实成熟过程的表达

从成熟中华猕猴桃果实中克隆到了一个 β 半乳糖苷酶基因cDNA片段 ,其长度为 747bp ,有一由 2 49个氨基酸组成的开放阅读框架 ,它与苹果、芦笋、绿花椰菜、番茄中 β 半乳糖苷酶基因cDNA相应区段的核苷酸同源性为 6 7.3 %～ 70 .3 %,氨基酸同源性为6 9.1%～ 72 .7%。用该片段为探针进行Northern分析表明 ,果实采收时 ,β 半乳糖苷酶mRNA水平最高 ,随后呈下降变化 ,同时 β 半乳糖苷酶基因的表达可为外源乙烯所诱导 ,但在果实乙烯跃变期间 β 半乳糖苷酶基因的表达信号无显著变化。文中对 β 半乳糖苷酶在猕猴桃果实成熟衰老过程的作用进行了讨论     

介绍一种鉴定胚胎干细胞基因打靶快速、经济的筛选新方法

小鼠基因剔除动物模型越来越广泛地应用于哺乳动物基因功能与疾病的研究。然而每当胚胎干细胞同源重组的效率过低时,鉴定与分离带有定位变异的阳性克隆就会既费力又昂贵。本工作以类固醇受体共激活子基因为例,研究出一种快速鉴定阳性克隆的新方法。在构造重组载体时,将一段编码半乳糖苷酶的DNA序列整合到共激活子基因的蛋白起始码后面。于是,在干细胞内同源重组发生以后,半乳糖苷酶的表达就会受控于内源性共激活子基因的启动子。在载体与半乳糖苷酶DNA随机整合的大多数非特异克隆中,因为缺少启动子或由于不正确的氨基酸编码连接,导致合成半乳糖苷酶的可能性较小。因此,在半乳糖苷酶染色阳性的克隆中,具有特异突变的阳性克隆可以富集30倍以上。从半乳糖苷酶的阳性克隆中,再用Southern Blot方法进一步确认带有基因剔除的阳性克隆就大大减少了工作量。因为半乳糖苷酶的细胞化学染色法简便而可靠,所以在重组效率低时,可以用这种方法在短期内筛选大量克隆。但是应该注意,应用该方法的前提条件是所研究的基因必须在胚胎干细胞内表达。这些方法更为重要的意义在于当带有基因剔除的胚胎干细胞发育成小鼠后,半乳糖苷酶的组化染色法可以轻而易举地用来揭示所研究基因在动物不同组织与细胞中的表达水平。     

假单胞菌M18转录调节因子σS基因与无启动子lacZ 基因融合突变株的构建和鉴定

通过菌落原位杂交和Southern 杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β半乳糖苷酶基因（′lacZ）插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18 rpoS基因突变株M18SZ。 Miller法测定显示,突变株M18SZ的β-半乳糖苷酶可高达480U,而野生株检测不到β半乳糖苷酶活性。表明,突变株中的rpoS基因与无启动子β-半乳糖苷酶基因已融合并且表达。在KMB培养基中生长量测定（OD600）的结果表明,突变株与野生株生长存在显著差异。     

枯草杆菌启动子－信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗性基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢｏｍＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接,转化大肠杆菌Ｃ６００,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧链终止法测定了１０个克隆片段的ＤＮＡ顺序,结果表明,克隆的片段都含有启动子、核糖体结合优点及信号肽序列。克隆片段可以在大肠杆菌和枯草杆菌中恢复氨苄青霉素抗性的表型。β－内酰胺酶活力测定结果证明：大肠杆菌的酶活力主要积累在周质空间内而枯草杆菌的酶活力主要分泌到胞外。     

利用杆状病毒载体在棉铃虫血细胞中表达大肠杆菌β－半乳糖苷酶

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体pAc36O－B－gal与野生型的苜蓿丫纹夜蛾(AcNPV)DNA同时转染草地夜蛾细胞,经x—gal筛选和空斑纯化得到重组型杆状病毒AcNPV－β－gal。该重组病毒能有效地感染棉铃虫血细胞系,并高效表达出受AcNPV多角体蛋白启动子控制的、具有生物活性的外源基因产物－－β－半裂糖苷酶。80％以上的酶蛋白能分泌到细胞外,培养液中酶活可达每毫升50000单位以上,约相当于170μg酶蛋白。用要SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离表达产物和β－半乳糖苷酶在凝胶上的特异性显色反应分析,重组病毒在棉铃虫血细胞中表达的AcNPV多角体蛋白－－大肠杆菌β－半乳糖苷酶融合蛋白是以5种活性的多聚体或复合物形式存在的。     

人神经母细胞瘤株中β—淀粉样前体蛋白基因IL—1反应元件的研究

细胞因了ＩＬ－１β可以诱导ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神经母细胞瘤细胞中ＡＰＰ基因的转录,为了研究ＡＰＰ基因启动子区的ＩＬ－１β反应元件,用含不同长度ＡＰＰ启动子片段的报告基因载体,瞬时转染ＳＨ－ＳＹ５细胞,发现ＡＰＰ启动子在ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞中有较强活性,其中－４８８到３０３区为ＩＬ－１β诱导ＡＰＰ转录活性增加所必需,这个区域包括１个ＡＰ１结合位眯和１个ＨＳＥ元件。     

应用CTB基因启动子及信号肽序列构建分泌性表达系统

利用霍乱毒素B亚基基因的启动子、信号肽序列及ctx操纵子的转录终止信号构建了分泌性表达的质粒载体pMCOSS。Β－半乳糖苷酶基因克隆至霍乱毒素B亚基基因的信号肽序列下游后能得到高效分泌性表达。不同的宿主菌和培养基成分中对β-半乳糖苷酶的表达产量有较大的影响,以MM2为宿主菌、在玉米浆培养基中β－半乳糖苷酶的表达产量达4 lOOu／ml,产物的大部分分泌至细胞的周质,活力测定的结果与SDS—PAGE电泳测定结果基本一致,说明表达的β－半乳糖苷酶绝大部分都具有酶活性。构建的蛋白质分泌性表达的载体－宿主系统及合适的培养条件为易形成包含体的蛋白质的高效表达提供了一条新的途径。     

谷氨酸棒状杆菌启动子在枯草芽孢杆菌中的克隆及其序列分析

利用枯草芽孢杆菌启动子探针质粒pPL 603为载体,从谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA上克隆到一个有较强启动功能的DNA片段。生物素标记的DNA—DNA分子杂交实验证明该片段确实来自谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA。在绘制该片段限制酶酶切图谱的基础上,经另一个启动子探针质粒pPL 703的亚克隆,将其启动子功能区定位在Bamm酶切片段中。对后者进行了核苷酸序列分析,发现它具有棒状杆菌类启动子的－35区和－10医序列。     

酵母高效克隆表达T载体pYES2-T的构建及应用

为了在酵母中高通量、高效率地对外源基因进行克隆和表达,本研究以酵母表达载体pYES2为基础,构建高效克隆表达T载体。pYES2是酿酒酵母的一种高效表达载体,在其多克隆位点处设计插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ片段,同时将其载体中URA3基因中原有的XcmⅠ酶切位点进行定点突变,构建出pYES2-T酿酒酵母高效表达T载体。利用XcmⅠ酶切载体pYES2-T,使其产生两个突出的T末端,一方面可以通过PCR产物加A的方式直接进行TA克隆;另一方面可在半乳糖诱导启动子的调控下,对TA克隆后的外源基因在酵母中诱导表达。利用该系统高通量地对人工合成耐盐系列基因NLEAs进行筛选,研究结果表明,该系统可以在酿酒酵母中一步式完成片段克隆及耐盐基因的筛选。本研究构建的酵母表达T载体使用方便、效率高、成本低,应用前景广阔。     

乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列的鉴定及在小鼠乳腺细胞表达LacZ基因的研究

乳清酸蛋白（ＷＡＰ）是小鼠乳中的主要蛋白质．在亚克隆该基因的基础上,对其进行了酶切鉴定,并对该基因５′区进行克隆和序列分析,在核实序列正确后,构建了以其为调控序列,指导β－半乳糖苷酶基因的真核表达质粒,采用直接注射质粒的方法在小鼠乳腺中表达出β－半乳糖苷酶活性,从而证实基因调控序列的功能正确性,可以用于转基因动物乳腺表达研究,同时证实该方法可以作为一种暂时性表达载体的验证方法．     

46,XY女性性反转患者SRY基因启动子区一个新的点突变及其功能分析

通过ＤＮＡ序列测定在一名４６,ＸＹ女性性反转患者ＳＲＹ基因启动子区发现了一个新的突变：ｎｔ．－８１Ｇ→Ａ．该突变不见于正常男性,因此不是ＤＮＡ多态性．为了检测这一点突变对ＳＲＹ基因表达功能的影响,构建了分别由正常或突变的人ＳＲＹ基因启动子区片段调控氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）报告基因表达的两个质粒,寡核苷酸探针杂交证实该启动子片段正常或携带有Ｇ→Ａ突变．这两个质粒分别与ｐＳＶ－β－半乳糖苷酶内对照质粒共转染ＨｅＬａ细胞后,瞬间表达分析显示这一突变对ＣＡＴ酶活性水平无显著影响（０．５０＞Ｐ＞０．２０）．上述正常和突变的ＳＲＹ基因启动子片段与Ｋ５６２细胞核抽提物的凝胶阻滞实验也表明,突变对Ｋ５６２细胞核蛋白与ＳＲＹ基因启动子区的结合影响不大．研究ＳＲＹ基因的表达调控对阐明人的性别决定机制及性反转的病理机制具有重要意义