链霉菌ε-聚赖氨酸发酵过程中的氧化胁迫效应

【目的】探究ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌对p H和ε-PL的耐受性、氧化胁迫与ε-PL合成之间的关系。【方法】选取3株ε-PL产生菌Streptomyces sp.AF3-44、Streptomyces sp.AS32和Streptomyces albulus F15,比较其在发酵性能、p H和ε-PL耐受性以及抗氧化胁迫能力上的差异,并对菌株发酵过程的活性氧成因进行分析。【结果】在3株菌中AF3-44具有最强的p H和ε-PL耐受性及抗氧化胁迫能力,因而在发酵后期能够保持良好的细胞活性和最高的ε-PL浓度;ε-PL引起的氧化胁迫主要发生在发酵前期,而发酵中后期氧化胁迫的产生主要由酸性p H导致。【结论】提高链霉菌ε-PL发酵过程中的抗氧化胁迫能力,可提升菌体活力和发酵水平。     

ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定

建立了一种灵敏的ε-PL产生菌高通量的筛选方法。在分离培养基中加入150mg／L K2Cr2O7,以有利于放线菌的富集分离;并添加美蓝染料,利用产碱菌株碱性分泌物和美蓝之问的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产碱菌株;利用Dragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应从产碱菌株中检出得到46株生物碱产生株;最后对产生物碱的菌株的发酵液进行ε-PL含量分析,确定4株ε-PL产生菌株。对其中一株ε-PL高产菌PL6-3菌株进行形态、生理生化和16S rDNA分析,结果表明PL6-3为北里孢菌属（Kitasatospora）。     

ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定*

建立了一种灵敏的ε-PL产生菌高通量的筛选方法。在分离培养基中加入150mg/LK₂Cr₂O₇,以有利于放线菌的富集分离;并添加美蓝染料,利用产碱菌株碱性分泌物和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产碱菌株;利用Dragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应从产碱菌株中检出得到46株生物碱产生株;最后对产生物碱的菌株的发酵液进行ε-PL含量分析,确定4株ε-PL产生菌株。对其中一株ε-PL高产菌PL6-3菌株进行形态、     

ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2的分离鉴定

【目的】ε-聚赖氨酸是一种天然氨基酸同聚物,本研究目的为分离筛选新的ε-聚赖氨酸产生菌。【方法】采用一种新的分离方法从土壤中分离ε-PL产生菌。分离方法含3步:(1)富集培养ε-PL耐受菌;(2)通过改进的Nishikawa方法筛选;(3)挑选高浓度ε-PL耐受菌株。【结果】从海南省土样中分离获得ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2。分类和形态特征属链霉菌属。16S rDNA序列分析比对结果表明TUST-2属淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)。经特征反应分析、水解物分析、红外光谱、1H NMR、13C NMR和MALDI-TOF-MS分析表明TUST-2发酵产物为ε-聚赖氨酸。【结论】根据16S rRNA基因序列比对和形态及生理生化特征表明ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2属于淀粉酶产色链霉菌,命名为淀粉酶产色链霉菌TUST-2。     

ε-聚赖氨酸高产菌选育与发酵性能评价

【目的】选育ε-聚赖氨酸(ε-PL)高产菌,并探究不同碳源对其发酵性能的影响。【方法】借助基因组重排和核糖体工程两种育种手段强化ε-PL产生菌的合成能力,并利用p H冲击工艺评价不同碳源对ε-PL发酵的影响。【结果】经过4轮基因组重排和4轮核糖体工程连续选育,获得1株高产突变株Streptomyces albulus GS114,其摇瓶ε-PL产量达到3.0 g/L,较出发菌提高了1.7倍。该改造菌株在5 L发酵罐中分别以葡萄糖和甘油为碳源进行192 h的补料-分批发酵时,ε-PL发酵产量分别达到了43.4 g/L和45.7 g/L,较出发菌提高了11.0%和14.9%,而菌体量分别减少了24.0%和33.2%,ε-PL得率提高了34.2%和30.7%。【结论】基因组重排结合核糖体工程育种是一种有效的ε-PL高产菌选育手段,研究结果将为ε-PL高产菌改造和工业生产碳源选择提供直接指导。     

核糖体工程技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

【目的】利用核糖体工程技术选育Streptomyces albulus AS3-14的链霉素和利福平双重抗性突变株,以提高其ε-聚赖氨酸合成能力。【方法】通过链霉素抗性筛选,获得链霉素抗性的ε-聚赖氨酸产量提高突变株;在此基础上,继续筛选其利福平抗性突变株,实现链霉素和利福平双重抗性ε-聚赖氨酸高产菌选育。【结果】获得的双重抗性高产突变株Streptomyces albulus WG-608的ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到3.7 g/L,5 L发酵罐补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量达到53.0 g/L,较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%。【结论】链霉素和利福平双重抗性选育能够显著提高ε-聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus的产物合成能力。     

链霉菌M-Z18膜蛋白ε-聚赖氨酸降解酶的分离纯化、酶学性质及应用

【目的】研究链霉菌Streptomyces sp.M-Z18ε-聚赖氨酸降解酶(Pld)的分离纯化及其生理生化特性,并利用该酶制备低聚合度ε-聚赖氨酸(ε-PL)。【方法】菌体细胞经超声破碎、NaSCN溶解和HiTrapTMButyl HP疏水层析制备到Pld,随后研究了其酶学性质、动力学和降解ε-PL过程,最后利用常量稀释法比较了不同聚合度范围ε-PL的最小抑菌浓度。【结果】从Streptomyces sp.M-Z18细胞膜上分离纯化到Pld,纯化倍数为80.4倍,回收率达到59.3%。以L-赖氨酰对硝基苯胺为底物,酶促反应的最适温度为37℃,最适pH为7.0,动力学常数Km为0.621 mmol/L,Vmax为701.16 nmol/min·mg;酶活在pH 7.0-10.0和50℃以下稳定。降解ε-PL实验发现,纯化到的Pld以内切方式降解ε-PL。抑菌实验表明,高聚合度ε-PL(30-35)对细菌的抑制效果较好,而低聚合度ε-PL(8-20)更有利于抑制酵母菌的生长,各种聚合度ε-PL对霉菌的生长抑制均较差。【结论】从ε-PL产生菌中分离纯化到内切型ε-PL降解酶,发现不同聚合度范围ε-PL对微生物的抑制能力存在显著差异。     

一株产ε-聚赖氨酸的白色链霉菌遗传转化体系

为了更好地研究ε-聚赖氨酸(ε-PL)生物合成的分子机制以及构建ε-PL高产基因工程菌株,拟建立一株ε-PL产生菌株Streptomyces albulus PD-1的遗传转化体系。通过对培养基类型、孢子预萌发处理、培养基中Mg2+浓度等条件进行考察,以Escherichia coli ET12567(p UZ8002)为供体菌,成功地将p IB139质粒导入S.albulus PD-1中。结果表明:质粒转化效率达到(3±0.4)×10-6个接合转化子/受体。接合子传代实验和PCR结果发现,p IB139质粒能够稳定整合在S.albulus PD-1染色体的att B位点上。本研究建立了一株ε-PL生产菌株的遗传转化体系,为从分子水平上研究ε-PL的合成及ε-PL高产菌株的构建奠定了基础。     

番茄灰霉病生防链霉菌筛选及鉴定

【背景】由灰葡萄孢侵染所致的番茄灰霉病是一类重要的真菌病害,生物防治具有环境友好、病原菌不易产生抗药性等特点,是果蔬灰霉病绿色防控的有效措施。【目的】筛选对番茄灰霉病具有防病作用且能促进番茄种子发芽的广谱拮抗性链霉菌,并明确该菌株种级分类地位。【方法】采用琼脂块法筛选拮抗番茄灰霉病菌的链霉菌菌株,采用对峙培养法和生长速率法检测菌株T22抑菌谱,通过产胞外酶活性检测、离体叶片防效和种子发芽试验明确该菌株的防病促生相关特性,根据形态学特征、生理生化特性和分子生物学方法对该菌株进行种类鉴定。【结果】从分离的56株放线菌中筛选到14株对番茄灰霉病菌具有拮抗效果的放线菌菌株,其中链霉菌T22对番茄灰霉病菌抑制作用最强,且具有较广抑菌谱,同时菌株T22具有产生纤维素酶和几丁质酶的能力。菌株T22无菌发酵滤液对番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、黄瓜枯萎病菌抑菌率分别为84.6%、81.5%和79.1%;其无菌发酵滤液原液对番茄灰霉病离体防效为55.1%;100倍稀释液处理番茄种子,胚轴、胚根和种子活力指数分别增加15.1%、29.7%和43.9%。根据形态学特征、生理生化特性和多基因聚类分析将链霉菌T22鉴定为白黑链霉菌(Streptomycesalboniger)。【结论】白黑链霉菌T22具有较强的抗真菌、产胞外酶、防病和促生活性,在番茄灰霉病生物防治中具有较好的开发应用潜力。     

一株转化琼胶为新琼寡糖菌株的筛选及鉴定

摘要:【目的】筛选一株可以将琼胶转化为新琼寡糖的菌株,并对该菌株进行鉴定。【方法】从紫菜生长区域采集紫菜和该区域海水,用含1‰琼胶的培养基富集培养,逐级稀释涂布、平板划线进行初筛,液体培养进行复筛,DNS法测定琼胶降解产物中还原糖的含量。通过16S rDNA序列分析,结合菌体形态、菌落特征及生理生化特性,确立该菌的系统发育学地位。【结果】从紫菜振荡液中筛选出一株可以产琼胶酶的菌株HJPHYXJ-1,该菌属于革兰氏阴性菌,16S rDNA序列同源性与需钠弧菌(Vibrio natriegens)的达到了99%,结合形态特征和生理生化实验结果鉴定该菌为需钠弧菌。HPLC法测定酶解产物为新琼寡糖。【结论】HJPHYXJ-1被筛选用于转化琼胶,酶解产物的聚合度在2－12 之间,是以二糖为单位的新琼寡糖,该菌产生的酶为β-琼胶酶。     

西藏林芝土壤放线菌抗肿瘤活性菌的筛选及鉴定

【目的】筛选并鉴定西藏林芝八一镇土壤中产生抗肿瘤活性物质的放线菌。【方法】用平板稀释法分离放线菌, 用MTT法和纸碟法对放线菌发酵产物进行体外抗肿瘤与抑菌活性检测, 并用多相分类技术对抗肿瘤活性菌株进行鉴定。【结果】共分离出29株放线菌, 得到6个抑制体外肿瘤细胞增殖的活性菌株(20.7%), 同时它们也具有抑菌活性, 其中4株菌的检测样品对Hela细胞的抑制率达80%以上。多相分类研究表明, 6个活性菌株分别隶属于链霉菌属(Streptomyces)的3个已知物种的变种。【结论】林芝八一镇土壤放线菌中蕴藏抗肿瘤活性链霉菌, 是一个潜在的抗肿瘤药用微生物资源。     

应用柱前衍生化高效液相色谱法开辟了一种简单、快速的DNJ产生菌的筛选途径

【目的】应用柱前衍生化高效液相色谱法筛选产1-脱氧野尻霉素(DNJ)菌株,并对其进行系统鉴定。【方法】利用芴甲氧酰氯(FMOC-Cl)柱前衍生化高效液相色谱法筛选DNJ产生菌;通过形态特征、培养特征、生理生化特征以及16S rRNA序列相似性分析等多项分类方法对DNJ产生菌进行鉴定;在10 L发酵罐水平进行发酵研究,利用FMOC-Cl柱前衍生化高效液相色谱法测定DNJ含量。【结果】从80株具有α-糖苷酶抑制剂活性的土壤放线菌中筛选得到一株DNJ产生菌,菌株编号为PW409,初步确定为戈壁三素链霉菌(Streptomyces gobitrici);发酵研究表明,DNJ为链霉菌PW409的次级代谢产物,发酵液中DNJ浓度为12.1 mg/L。【结论】首次将FMOC-Cl柱前衍生化高效液相色谱法应用于DNJ产生菌的筛选,并首次报道从戈壁三素链霉菌发酵液中鉴定到DNJ。     

聚-ε-赖氨酸高产菌株的筛选及其发酵工艺的初步研究

利用亚甲基蓝平板初筛、摇瓶复筛,从土壤中筛选了一株聚-ε-赖氨酸(ε-PL)高产菌株,ε-PL摇瓶产量大于2g/L,经初步鉴定该菌株为白色链霉菌(Streptomyces albulus)。对该菌株发酵生产ε-PL的培养基成分进行初步研究表明:葡萄糖是最好的碳源,酵母粉和硫酸铵是最佳的复合氮源,在优化培养基下,ε-PL摇瓶产量达到3.9g/L。     

产黑色素海洋放线菌的分离、鉴定和产色素条件优化

【目的】从连云港高公岛沿岸海底泥样中分离筛选到一株产黑色素的海洋放线菌。【方法】对筛选得到的菌株HT-18所产的色素进行紫外-可见吸收光谱、红外光谱分析。通过形态特征、培养特征、生理生化测定以及16S rRNA序列的系统发育学分析确定菌株HT-18的分类学地位。采用单因素对产色素发酵条件进行优化。【结果】菌株HT-18所产色素为黑色素。鉴定该菌株属链霉菌属(Streptomyces)。最佳产色素条件为:初始pH7.0,装液量为70/250 mL,温度31°C,发酵时间为3 d。【结论】海洋链霉菌HT-18是一株具有研究和应用潜力的产黑色素菌株。     

ε-聚赖氨酸高产改造菌发酵过程分析与工艺改进

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是我国新近批准的一种天然食品防腐剂,由链霉菌好氧发酵制备而来。通过传统育种手段强化产生菌ε-PL合成能力是提高其发酵水平的重要途径,然而高产改造菌与出发菌株发生的生理改变却很少被关注。本研究从培养特征,营养需求和发酵过程参数等方面进行比较与分析,发现高产菌株Streptomyces albulus GS114具有需氧量小、菌体量低、ε-PL产量高、单位菌体ε-PL合成能力强、转化率高等特点。为了进一步提高S.albulus GS114的ε-PL产量,通过提高pH冲击策略中预培养p H增加其菌体量,实现ε-PL产量达到53.49 g/L,较优化前提高了11.9%。研究结果将为ε-PL工业化生产奠定基础。     

一株抗茶炭疽菌和魔芋镰刀菌的淀粉酶产色链霉菌的分离、鉴定及生防潜能

【背景】放线菌是一类重要的生防菌,具有强大的代谢活性,能产生抗生素、酶、酶抑制剂和激素等天然产物抑制病原物生长。【目的】从茶树根际分离得到放线菌,研究候选放线菌对茶炭疽菌和魔芋镰刀菌的抑菌活性及其生防潜能。【方法】分别以茶炭疽病致病菌Colletotrichum camelliae和魔芋茎腐病致病菌Fusarium solani为指示菌,采用土壤稀释涂布法、平板对峙法和菌丝生长速率法,从茶树根际土壤中分离、筛选拮抗放线菌,并根据菌株的形态特征、生理生化特性和系统发育分析结果对其进行分类鉴定,并开展候选放线菌的产促生相关物质和分泌细胞壁水解酶能力的定性检测试验。【结果】共分离得到14株拮抗放线菌,菌株A-dyzsc04-2的拮抗效果最强,被鉴定为淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）。该菌株的活菌体对C. camelliae和F. solani的抑制率分别为66.71%±1.23%和71.59%±2.46%,其无菌发酵滤液对2种指示菌的抑菌率均大于90%;此外,菌株A-dyzsc04-2还具有产嗜铁素和葡聚糖酶以及溶解无机磷的能力。【结论】菌株A-dyzsc04-2是一株优良的生防菌,具有较高的开发利用价值,研究结果为菌株A-dyzsc04-2防治茶炭疽病和魔芋茎腐病提供了理论支撑。     

高产铁载体棉田土壤细菌SS05的筛选与鉴定

【目的】研究从棉田土壤中筛选得到的高产铁载体细菌产铁载体能力、分类地位和抑菌活性。【方法】通过改良蔗糖-天冬氨酸培养基选择性筛选产铁载体细菌,通过分光光度计法测定铁载体活性,通过混菌法测定产铁载体细菌上清液对棉花枯萎病致病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑菌效果,采用形态学、生理生化鉴定及16S rDNA序列系统发育分析对高产铁载体菌株进行鉴定。【结果】从棉田土壤中筛选到162株产铁载体细菌,30株产铁载体能力较强的细菌中21株具有较高产铁载体能力,菌株SS05的铁载体活性单位达到98.3%;在低铁条件下,SS05上清液对F.oxysporum具有显著的抑制作用;SS05与莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)最为接近。【结论】SS05是高产铁载体菌株,与莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)最为接近,在低铁培养条件下其上清液对F.oxysporum具有显著的抑制作用。     

香蕉林土壤可培养放线菌分离、鉴定及其抑菌活性

【背景】香蕉枯萎病是香蕉的顽固性疾病,制约着香蕉产业的发展,因此,筛选出对香蕉枯萎病菌(尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种,简称Foc4)具有抑制活性的生防菌株具有重要意义。【目的】分离香蕉林土壤样品中放线菌并进行物种的初步鉴定,测定其对包括香蕉枯萎病致病菌的7种病原菌的拮抗活性,获得高活性菌株,以获得解决香蕉枯萎病的生物防治策略。【方法】采集多份广西地区香蕉林土壤样品,采用超声波等手段对其预处理,设置多种特异性培养基从中分离放线菌资源,对获得的放线菌进行基于16SrRNA基因序列的物种鉴定,以7种病原菌为靶标,采用平板对峙法从中筛选抑菌活性菌株,最后采用菌丝生长速率法对Foc4的抑菌率进行测定。【结果】从香蕉林土壤中分离出138株放线菌均为链霉菌,其中5株为潜在新种,分别为X1085、X1052、X2052、X3059和X4046;筛选出具有抑菌活性的菌株77株,阳性率为55.8%。20株对Foc4具有抑制活性,其中4株拮抗效果明显,抑制率大于80%,菌株X4050的抑菌率高达93.76%。【结论】初步明确了香蕉林土壤中可培养放线菌的物种信息,其中部分放线菌为未知物种,活性分析显示一半...     

邳州银杏内生放线菌分离、筛选及活性菌株鉴定

【目的】从银杏中分离、筛选得到具有抑菌作用的内生放线菌,为放线菌在生物防治上的应用提供新的菌种资源。【方法】采用组织贴片培养法进行分离,生长对峙法进行筛选。【结果】从银杏的根、茎、叶中分离得到98株、50株、8株内生放线菌(共计156株),47株放线菌具有拮抗植物病原真菌活性。菌株KLBMP 5501抗菌活性最好且具有广谱性,基于形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列的相似性分析等多项分类特征表明,菌株KLBMP 5501是一株浅紫链霉菌(Streptomyces violascens)。【结论】筛选得到了具有应用潜力的高活性菌株,并进行了菌种鉴定。     

一株链霉菌21-1的分离鉴定及其对禾谷镰刀菌的抑菌活性

【背景】由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病严重威胁我国的小麦生产。【目的】筛选对禾谷镰刀菌具有拮抗能力的链霉菌菌株,为生防菌剂开发提供理论基础。【方法】利用平板对峙法筛选对禾谷镰刀菌具有拮抗能力的链霉菌;通过形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定;通过病原菌菌丝生长、孢子产生及萌发抑制试验分析其发酵液的抑菌活性;利用人工接种试验测定该菌株发酵液的防病效果。【结果】筛选到一株对禾谷镰刀菌具有较强拮抗活性的链霉菌21-1,抑菌率为59.5%。依据形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,将该菌株鉴定为黄三素链霉菌(Streptomycesflavotricini)。菌株21-1发酵液能够抑制禾谷镰刀菌的菌丝生长、孢子产生及萌发过程,而且可以降低禾谷镰刀菌菌丝中可溶性蛋白质的含量,并增加丙二醛的含量。菌株21-1可以产生蛋白酶及纤维素酶。菌株21-1菌液10倍稀释液对小麦赤霉病的防效最佳,为70.1%。此外,菌株21-1发酵液对其他8种植物病原菌均有较好的抑制作用。【结论】菌株21-1对禾谷镰刀菌有较好的抑菌活性,具...