骨组织工程血管化的研究进展

血管化是组织工程骨成活的关键,组织工程骨的血管化过程与生理情况下的血管发生相似,但又有其独特性,并受多种因素影响。基于对组织工程骨血管化过程的认识,研究者通过联合细胞培养、促血管化生长因子、显微外科等方法重建血运。本文综述了当前骨组织工程的血管化研究进展。     

血管内皮细胞的结构和功能

血管内皮细胞是一个多功能细胞。本文重点介绍血管内皮细胞的形态结构、生理功能及在抗血栓中的作用。     

新型复合血管制血中内皮细胞培养的初步研究

目的：为制备新型复合血管,对内皮细胞的体外培养进行研究。材料和方法：新生儿脐带静脉４８条,分别应用酶消化法,巾壁法和机械刮取法获得内皮细胞,以含２０％的胎牛血清Ｍ１９９液进行培养,相关镜下观察其巾壁和生长规律。结果：以酶灌注法优于内膜刮取法和内膜贴壁法;而酶灌注法以消化１５至２０分钟获取细胞和贴壁较多,采取两次消化法较一次消化法效果为佳。结论：三种方法获得和培养的内皮细胞,在数量上用于制备新型复合     

新型复合血管制备中内皮细胞培养的初步研究

目的:为制备新型复合血管,对内皮细胞的体外培养进行研究。材料和方法:新生儿脐带静脉48条,分别应用酶消化法,贴壁法和机械刮取法获得内皮细胞,以含20％的胎牛血清M199液进行培养,相差镜下观察其贴壁和生长规律。结果:以酶灌注法优于内膜刮取法和内膜贴壁法;而酶灌注法以消化15至20分钟获取细胞和贴壁较多,采取两次消比法较一次消化法效果为佳。结论:三种方法获取和培养的内皮细胞,在数量上用于制备新型复合血管受到一定限制,有关研究有待进一步探讨。     

微重力对血管及血管内皮细胞的影响

血管系统功能紊乱是微重力诱导立位耐力不良发生的重要因素之一。血管内皮细胞是覆盖在血管内壁上组成血管管腔面的一层单层细胞,是血管壁的重要组成部分,并且在血管功能调控中起到渗透屏障、调节舒缩等重要作用。近年研究发现,微重力可对不同部位的血管系统和血管内皮细胞产生不同的影响,比如可使脑动脉缩血管反应性增加、舒血管反应性下降,颈动脉和腹主动脉缩血管和舒血管反应性下降,肺动脉缩血管反应性下降、舒血管反应性增加,肠系膜动静脉和下肢动脉缩血管反应性下降。另外,微重力可促进大血管来源的内皮细胞生长,但抑制微血管来源的内皮细胞的生长。本文就微重力对血管及血管内皮细胞影响的研究进展作一概述。     

体外研究血管内皮细胞单层通透性的新方法

血管壁通透性增高足创伤、烧伤、感染、休克和炎症等病理过程的重要变化和特征,其机理尚不十分清楚。内皮细胞是血管壁的主要通透屏障,研究内皮单层的通透性特征及其在病理情况下的变化机制对人们了解血管壁的通透性增高机制和寻找临床防治方法有着极为重要的意义。我们建立了用体外培养的内皮细胞单层研究通透性的装置,可以较为准确地测定内皮单层对液体的滤过系数Kf,便于体外研究各种体液因子和炎症介质对血管通透性的影响及其机制,也可用于研究白细胞-内皮细胞的相互作用。     

小鼠胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的永生化研究

本文探讨了小鼠胚胎干细胞（ES细胞）、诱导分化的血管内皮细胞永生化。在体外培养系统中,以维甲酸（RA）和转化生长因子－β1（TGF－β1）诱导小鼠胚胎干细胞（ES细胞）的拟胚体（EB）分化为“圆形细胞”和由这些“圆形细胞”组成的血管样结构。经光学和扫描电镜及免疫荧光等法分析检测,证明组成血管样结构的细胞具有专一性vWF荧光染色,表明是血管内皮样细胞。利用脂质体将人端粒酶催化亚基逆转录酶（hTERT)基因转染诱导分化中的“圆形细胞”。应用Dot-blot,RT－PCR,Western blot及免疫组织化学等方法分析、观察和证明了诱导分化的组成血管样结构的园形细胞和被hTERT基因转染的“圆形”细胞的形态和生物学特性。结果表明,携带hTERT基因的从ES细胞分化来的圆形细胞在体外可大量增殖,持续传代,95％具有血管内皮细胞的一些特有标志和管道化生长特征。因此,通过人端粒酶基因的转染途径可解决由ES细胞诱导分化而来的内皮细胞扩增和永生化问题,为构建组织工程化血管及其它人工血管的内皮化提供种子细胞来源打下基础。     

不同应激损伤所致血管内皮细胞中vWF的变化

目的：通过检测血管内皮细胞（ＶＥＣ）中ｖＷＦ的变化,评价ＶＥＣ的损伤。方法：利用免疫组化技术对体外培养的猪肺动脉内皮细胞（ＰＡＥＣ）和大鼠主动脉内皮细胞（ＡＥＣ）中ｖＷＦ进行免疫荧光标记,通过流式细胞仪对ｖＷＦ的细胞阳性率和荧光强度进行定性、定量分析,观察低氧和低温所引起的ｖＷＦ变化。结果：正常猪ＰＡＥＣ和大鼠ＡＥＣ的ｖＷＦ阳性率在８０％左右,阳性程序较高。但缺氧或冷冻损伤可使ＰＡＥＣ和ＡＥＣ的ｖ     

血管内皮细胞生长因子及其相关蛋白的结构与功能

血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）是在胚胎发生和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异的有丝分裂原,也是一种有效的血管通透性诱导因子,ＶＥＧＦ是胱氨酸结生长因子超家族的一员,它与其受体的结构细节和工能特征为设计分子拮抗剂提供了重要依据。其结构特征和生物学特性使之在缺血组织重组侧支循环,肿瘤预后,肿瘤转移乃至实施基因治疗等领域成为重要的研究对象。     

血管内皮细胞生长因子复性条件研究

利用大肠杆菌 BL2 1 (DE3)表达血管内皮细胞生长因子 (VEGF16 5)表达蛋白以包含体形式存在。为了获得有生物活性的蛋白质 ,我们对影响复性的参数 :氧化型、还原型谷胱甘肽比例 ,复性液的 p H值 ,复性时间 ,精氨酸浓度 ,血管内皮细胞生长因子起始浓度进行了较为系统的研究 ,初步获得了具有一定生物活性的 VEGF16 5二聚体蛋白。     

oxLDL对血管内皮细胞的损伤机制

天然的低密度脂蛋白(LDL)经氧化修饰形成氧化低密度脂蛋白(oxLDL).天然LDL核心的脂肪酸中含有大量不饱和脂肪酸,约占LDL总脂肪酸含量的35-70%,所以容易发生自身氧化.oxLDL具有一系列生物学毒性作用,氧化修饰后的LDL不能经LDL受体代谢,由清道夫受体识别、结合、内吞饮入细胞并逃逸正常的胆固醇代谢途径,引起细胞内脂质沉积,泡沫样变.oxLDL引发动脉粥样硬化的机制之一就是损伤血管内皮细胞,因此细胞损伤机制的进一步阐明将为改善内皮细胞功能和治疗动脉粥样硬化提供新的思路.     

人血管内皮细胞中腺苷代谢的定量研究

目的:通过对人脐静脉内皮细胞腺苷分泌进行定性及定量研究,了解人类血管内皮细胞的腺苷代谢及机制.方法:收集并测定不同干预下细胞柱流出液中分离的人脐静脉内皮细胞分泌的腺苷量.结果:在无干预、抑制腺苷激酶及去氨酶、抑制细胞膜腺苷转运情况下,人脐静脉内皮细胞腺苷分泌率分别为13.5±7.1 pmol·min-1·mg-1、32.5±14.2 pmol·min-1·mg-1和20.8±15.7 pmol·min-1·mg-1.结论:人类血管内皮细胞内腺苷合成高于胞外,而细胞膜腺苷转运被抑制后的腺苷分泌率反而高于生理状态下分泌率,则表明腺苷在胞内分解代谢非常迅速,使部分腺苷反由胞外扩散入胞内.     

合欢皮提取物抑制血管生成的体内药效学研究

为了探讨合欢皮提取物体内对血管生成的抑制作用。本文采用MTT法和Matrigel plug方法考察合欢皮提取物对人血管内皮细胞(HMEC)增殖和体内Matrigel胶小管形成的影响,运用Lewis肺癌转移小鼠模型,观察合欢皮提取物对小鼠Lewis肺癌的疗效。结果表明合欢皮提取物可明显抑制HMEC细胞的体外增殖(IC50为30μg/mL),并且呈明显的剂量依赖性,同时具有抑制Matrigel plug中的血管新生的作用。合欢皮提取物还能够明显抑制Lewis肺癌肿瘤细胞生长,减少转移病灶。提示合欢皮提取物具有明显抑制血管生成的作用,有可能成为有效的血管生成抑制剂。     

胰岛素促进血管内皮细胞产生一氧化氮的实验研究

目的：探讨胰岛素对血管内皮细胞增殖、NO产生和NOS基因表达的影响。方法：培养牛主动脉内皮细胞,测定培养上清液中NO氧化产物NO2^－的水平并应用定量RT－PCR技术检测内皮细胞NOS mRNA的表达水平。结果：①胰岛素对大血管内皮细胞无细胞毒作用,也不影响细胞增殖;②在1－15μg/ml浓度范围内,胰岛素加强内皮细胞释放NO,且呈剂量依赖的方式,NOS特异性抑制剂L－NAME可阻抑之;③胰岛素轻度增加NOS mRNA表达水平,但无统计学意义。结论：胰岛素既不影响大血管内皮细胞增殖,也不影响内皮细胞NOS mRNA表达水平,但以剂量依赖的方式加强内皮细胞产生NO,推测其诱导NO产生的机制可能是通过酶活性的诱导,加速NO的合成。     

褪黑素对脂多糖诱导血管内皮细胞损伤的保护机制研究

目的：研究褪黑素（melatonin,MLT）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的保护作用及其机制探讨。方法：不同浓度的褪黑素作用于体外培养的内皮细胞脂质过氧化损伤模型,实验分为5组,即正常对照组（Ctrl）,脂多糖（LPS）氧化损伤组：在培养基中加入2mmol／L的LPS诱导损伤4h;LPS加MLT低剂量（200t~mol／L）组、中剂量（400ixmol／L）组、高剂量（600txmol／L）gai。采用MTT法观察MET对HUVECs活性的影响;用双波长荧光分光光度法测定HUVECs细胞内游离钙离子浓度;检测各组内皮细胞匀浆中丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH·Px）活性;用ELISA法测定培养的细胞上清液中白细胞介素6（IL．6）表达的变化;并测定细胞凋亡率。结果：①LPS作用后血管内皮细胞损伤明显,细胞增殖减少,细胞培养上清液和细胞匀浆中MDA含量、细胞内钙离子浓度和IL．6均升高,SOD、GSH-Px活性下降,凋亡率可达38．9±1．1％,均与正常对照组有统计学差异（P〈0．01）;②加入MET可明显减轻LPS对抗氧化酶SOD、GSH—Px的影响,同时MDA含量、细胞内钙离子浓度和几一6均明显下降,并显著减少凋亡细胞数量,各指标差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：褪黑素可保护和修复LPS引起的血管内皮细胞损伤,其作用途径可能与保护细胞的线粒体,提高了该细胞的抗氧化酶活性,降低细胞内钙离子浓度作用有关。     

哇巴因作用于血管内皮细胞的基因表达谱分析

目的:研究0.3 nmol/L哇巴因(ouabain)作用下血管内皮细胞的基因谱改变.方法:以包含8464条人类基因的DNA芯片检测血管内皮细胞受0.3 nmol/L哇巴因活化后的基因表达谱.结果:血管内皮细胞受哇巴因作用2 h后,340条基因出现表达差异,其中上调的共有145 条,多数与细胞代谢和转录调控相关.结论:提示哇巴因可能参与血管内皮细胞的正常生长代谢.     

白念珠菌与血管内皮细胞黏附后的作用机制

白念珠菌与血管内皮细胞的相互作用是其是否造成血源性播散感染的中心环节,两者的黏附仅仅是作用的初级阶段、黏附的程度对两者作用的性质一感染控制和感染播散之间的关系并不明确。而在黏附后的相互作用研究中提示白念珠菌进入血管内皮细胞并造成其损伤继而进入其他组织,同时血管内皮细胞对白念珠菌感染也具有重要的保护作用,这种作用与血管内皮细胞对白念珠菌的内吞也密切相关。本文对两者黏附后血管内皮细胞对白念珠菌的吞噬,白念珠菌对血管内皮细胞的损伤以及血管内皮细胞对白念珠菌感染的保护作用方面作一综述。     

预血管化细胞膜片的构建

为探索新的体外获得毛细血管样网络结构来解决工程化组织预血管化的问题,该研究将人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)以9×104/cm2细胞密度体外连续培养形成细胞膜片,将培养的脐静脉血内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)以5×104/cm2细胞密度接种到上述间充质干细胞膜片上,并培养在内皮细胞培养介质中。在设计的时间点用倒置相差显微镜观察,发现内皮细胞在膜片上迁移,细胞重排,膜片上的基质蛋白也发生重排,导致微槽和空泡出现。CD31免疫荧光染色观察到进行性管腔形成的过程;CD90免疫荧光染色显示膜片上的hMSCs围绕着HUVECs周边排列,说明hMSCs作为周细胞支持了HUVECs的生长;在培养第10 d可见少量的α-SMA的表达,暗示着在此种培养模式下,hMSCs具有较低的向肌细胞分化的潜能。这些结果表明,将内皮细胞接种在未分化干细胞膜片上,可以在体外形成具有血管网络结构的预血管化膜片,为构建血管化工程化组织提供了新的思路。     

预血管化细胞膜片的构建

为探索新的体外获得毛细血管样网络结构来解决工程化组织预血管化的问题,该研究将人骨髓间充质干细胞（humanmesenchymalstemcells,hMSCs）以9×10^4／cm。细胞密度体外连续培养形成细胞膜片,将培养的脐静脉血内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs）v25x104／cm2细胞密度接种到上述间充质干细胞膜片上,并培养在内皮细胞培养介质中。在设计的时间点用倒置相差显微镜观察,发现内皮细胞在膜片上迁移,细胞重排,膜片上的基质蛋白也发生重排．导致微槽和空泡出现。CD31免疫荧光染色观察到进行性管腔形成的过程;CD90免疫荧光染色显示膜片上的hMSCs围绕着HUVECs周边排列,说明hMSCs作为周细胞支持了HUVECs的生长;在培养第10d可见少量的α-SMA的表达,暗示着在此种培养模式下,hMSCs具有较低的向肌细胞分化的潜能。这些结果表明,将内皮细胞接种在未分化干细胞膜片上,可以在体外形成具有血管网络结构的预血管化膜片,为构建血管化工程化组织提供了新的思路。     

小鼠胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的永生化研究

本文探讨了小鼠胚胎干细胞(ES细胞)诱导分化的血管内皮细胞永生化。在体外培养系统中,以维甲酸(RA)和转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的拟胚体(EB)分化为“圆形细胞”和由这些“圆形细胞”组成的血管样结构。经光学和扫描电镜及免疫荧光等法分析检测,证明组成血管样结构的细胞具有专一性vWF荧光染色,表明是血管内皮样细胞。利用脂质体将人端粒酶催化亚基逆转录酶(hTERT)基因转染诱导分化中的“圆形细胞”。应用Dot-blot,RT-PCR,Western blot及免疫组织化学等方法分析、观察和证明了诱导分化的组成血管样结构的园形细胞和被hTERT基因转染的“圆形”细胞的形态和生物学特性。结果表明,携带hTERT基因的从ES细胞分化来的圆形细胞在体外可大量增殖,持续传代,95%具有血管内皮细胞的一些特有标志和管道化生长特性。因此,通过人端粒酶基因的转染途径可解决由ES细胞诱导分化而来的内皮细胞扩增和永生化问题,为构建组织工程化血管及其它人工血管的内皮化提供种子细胞来源打下基础。