电泳亲和色谱技术分离蛋白质

亲和色谱利用亲和配体与目标组分间的特异性结合作用实现对目标组分的纯化,该分离方法分辨率高,在生物物质的分析和分离领域得到日益广泛的应用［１］。亲和色谱在分离过程每一步操作中,液相主体中的溶质分子必须经过一系列扩散过程才能进入到固定相颗粒孔内完成吸附或...     

蛋白质的染料亲和色谱分离纯化

介绍了三嗪染料配基亲和色谱(包括高效亲和色谱)分离纯化蛋白质的基本原理和方法,并介绍了染料亲和色谱固定相制备方法及应用的最新发展。     

蓝色染料配基亲和纯化眼镜蛇心脏毒素的研究

探索了蓝色染料（Cibacron Blue F3G-A）亲和分离中华眼镜蛇心脏毒素的可能性。采用环氧基活化法制备蓝色染料亲和介质,中性条件下提取眼镜蛇粗毒中的心脏毒素。Tricine系统SDS-PAGE多肽电泳和Lowry法蛋白定量分析纯化效果,发现蓝色染料琼脂糖一步纯化中华眼镜蛇心脏毒素的纯度达到84%,结合量为6.9mg/ml介质。这是首次利用小分子亲和配基纯化心脏毒素。与生物大分子配基相比,活性染料分子具有价格便宜,易于合成,性质稳定,不易降解和适合大规模生产等优点。     

辅酶Ⅱ-亲和胶的制备和应用

亲和层析是一种特异性较高的分离纯化方法,目前已广泛应用于多种生物物质的分离纯化。NADP是生物体内许多酶的辅酶,是一种很好的亲和配基。因此,将NADP结合到不溶性介质上,可得到一种分离纯化有关酶及蛋白质的亲和胶。本文介绍NADPSepharose 4B胶的合成方法及其应用。     

万古霉素的磁性亲和吸附分离

磁性亲和分离技术是近年新兴的一个分离方法,它可直接从初始样品液体中(无论是浑浊或清亮液)分离目标产物,克服了传统色谱方法需要离心和过滤除杂质的步骤,分离过程所用仪器极其简单,大大降低了操作费用,且易于实现规模化;此外,同亲和色谱一样也具有高的特异性及应用范围广等优点.使其在蛋白质、细胞的分离方面表现出了巨大的应用前景[1-4].万古霉素是一个多肽类的抗菌素,临床上用于治疗耐甲氧苯青霉素葡萄糖球菌的感染.目前虽有多种纯化方法[5,],但大多工艺复杂,回收率较低,尤其是在纯化过程中,万古霉素极易降解,迫使人们寻求更好的纯化方法来解决这个问题.     

纤维素微球色谱介质制备、孔结构调控及聚合物改性

作为色谱技术的核心,高效色谱介质的研制与开发是提高生物大分子纯化效率的重要手段之一.纤维素微球是最早应用于生物分离的色谱介质之一.这主要是因为纤维素的基本结构为多糖化合物,表面含有大量羟基,易于修饰功能配基,且非特异性吸附弱,特别适合不稳定生物大分子的分离纯化.本文综述了纤维素微球色谱介质的研究新进展.首先简要介绍了纤...     

A蛋白亲和色谱法纯化动物血清抗体的效果比较

比较Hitrap A蛋白琼脂糖凝胶亲和色谱系统,对不同动物血清或抗血清抗体的纯化效率,提供选择抗体纯化方法的依据。该方法简使快速,纯化的抗体纯度高,能较好地保持抗体免疫学活性。色谱柱反复使用40多次,纯化抗体效率不变。但A蛋白对不同动物血清的IgG吸附能力不同,对兔和豚鼠的血清抗体吸附能力强,而对小鼠、山羊和驴的血清抗体吸附能力较弱。说明虽然该方法纯化的抗体纯度高,但它对动物品种有选择。因此,应根据动物品种,选择适合的纯化方法。     

亲和层析法分离鉴定人类端粒酶复合体及其蛋白质组分分析

为分离纯化人类端粒酶复合体并对其蛋白质组分进行分析 ,自行设计一套特异的以端粒重复序列为配体 ,以亲和磁珠为介质 ,以竞争性碱基序列为洗脱原则的寡核苷酸亲和纯化法 ,对He La细胞端粒酶复合体进行分离纯化 .并采用近年发展起来的主要用于检测序列特异性 DNA结合蛋白的凝胶迁移阻滞分析法对纯化产物进行鉴定分析 .应用 SDS- PAGE对纯化蛋白质亚基组分进行分析与鉴定 ,并采用电泳迁移率和已知蛋白质分子质量标准的对数作图分析测得所得蛋白质亚基成分的相对分子质量 .结果表明 ,纯化产物以 TRAP法检测酶活性可见典型的梯形条带 ;比活性为每 mg蛋白质的 cpm值为 1 80× 1 0 9,纯化倍数 1 80 0 ,得率 90 % .凝胶迁移阻滞法分析显示特异的凝胶迁移阻滞性电泳条带 ;以 SDS- PAGE检测得到 4种蛋白质亚基成分 ,其蛋白质相对分子质量分别为 2 2 0 ku、2 1 2 ku、1 1 6ku和 43ku.由上述可见 ,采用自行设计的寡核苷酸亲和纯化法获得了人端粒酶复合体及 4种蛋白质亚基组分 .     

IDA型固定化镍离子金属螯合亲和膜色谱对人血清白蛋白的分离纯化

采用自制的固定化镍离子亚氨二乙酸(IDA)型复合纤维素金属螯合膜色谱对药用人血清白蛋白的进一步纯化进行了研究。考察了Ph对HAS吸附效果的影响。经一步纯化,商品药用HAS中的许多杂蛋白可被除去,经毛细管电泳分析,纯度与Sigma公司的电泳纯HAS相当,回收率可达85%以上。纯化蛋白液中的镍离子经过自制的N,N,N′-三羧甲基乙二胺(TED)型螯合柱处理后可较好地除去。     

制备型高效液相色谱法分离蛋白质的研究

生物工程的发展,特别是生化制品下游处理技术的兴起,对现代分离科学提出了更高的要求,研究和开发各类生化物质特别是活性生物大分子的分离纯化技术,已成为一项十分重要的研究课题。在现有的分离技术中,液相色谱,尤其是80年代在分析型高效液相色谱(HPLC)基础上兴起的制备型HPLC,在大规模分离纯化生物活性物质特别是蛋白质方面已显示出巨大的应用潜力,引起了各国研究者的高度重视^[1-5].本文利用自行设计的制备型HPLC分离装置,对牛血清白蛋白(BAS)和牛血清红蛋白(HG)的制备分离过程进行了实验研究,着重考虑了流动流速、柱超载方式、柱长等因素对BAS和HG分离度的影响。     

我国生物分离介质自主产业化进展

生物技术产业是21世纪最具发展潜力的行业。在生物技术产业化过程中,色谱技术已经成为下游纯化过程中公认的关键环节。决定着药物产品的生产成本．而支撑色谱技术的核心是色谱填料,即生物分离介质。因此．生物分离介质的制备及应用研究一直是生物技术产品从实验室走向应用的关键技术和核心技术。然而．多年来我国实验室研究、     

亲和电泳

<正>亲和技术在分离科学中具有重要的作用,能使生物分子依据其生物活性和化学结构而被分离。自从六十年代后期介绍亲和技术以来,它们已经广泛地用于从复杂的生物混和物中提纯物质。在此方法中,通过固定在支持物(载体)上的合适的结合物(配位体,待纯化的分子被特异地和可逆地吸附。虽然制备方法良好,但亲和层析技术通     

魔芋葡苷聚糖(KGM)凝胶为亲和层析载体与 Sepharose 4B的比较研究Ⅱ.KGM染料亲和层析分离人血清白蛋白

将KGM和Sepharose 4B凝胶在相同条件下活化、偶联接上染料Cibacron Blue F3GA制成了KGM和Sepharose 4B染料亲和吸附剂,并用来与牛血清白蛋白(BSA)作用,每毫升KGM亲和吸附剂可吸附BSA 28 mg,用NaSCN洗脱时回收为84.5%,而Sepharose 4B梁料亲和吸附剂每毫升可吸附BSA 15.3 mg,用NaSCN洗脱时回收为81.7%,并对两种凝胶的染料亲和吸附性能进行了比较.用KGM染料亲和吸附剂分离的人血清白蛋白与人血清白蛋白标准品有同样的纯度,都达到了电泳纯.     

多通道流动电泳技术及其在蛋白质、酶和抗体纯化中的应用研究

提出一种新型制备电泳方法即多通道流动电动电泳技术,建立了微机控制的电泳设备,考查了操作条件对设备分离效率的影响。应用该技术进行牛血清清蛋白(BSA)-牛血红蛋白(HBB)混合物的连续分离,每小时从含BSA、HBB各37.0mg的蛋白质混合物中分离出13.6mg的BSA和20.0mg的HBB。应用该技术进行尿激酶粗品的纯化,可将其比活力由4000IU/mg提高到4×10~4IU/mg以上,产量在10×10~4IU/h以上。将该技术与(NH_4)SO_4沉淀方法结合,从15ml免疫鼠血清中分离出12.5mg高纯度尿激酶抗体IgG,产量为2.1mg/h。上述结果证明多通道流动电泳技术具有分离速度快、精度高和可操作性好等优点,在生物产品分离领域中具有广阔的应用前景。     

连续自由流电泳的研制和应用于分离蛋白质和细胞

连续自由流电泳(Continuous free-flow dectrophoresis,CFE)自1980年起有了相当大的发展,其主要特点是将只能分析少量物质(1μg)的分析型电泳转变成能分离lg左右物质的制备型电泳,以达到分离和纯化各种生物产品目的^[1]。近年来CFE广泛应用于蛋白质和细胞分离,是一种很有前途的制备级电泳方法^[2,3]。在连续自由流电泳中,一种恒定pH称为载体缓冲液的液体．沿垂直方向缓慢流过一矩形的电泳薄腔,电泳腔的两侧是电极室,能被横向地加上直流电场,欲分离的蛋白质混合物通过一根细管从样品入口处连续注入腔体,随缓冲液措径向流动,同时又向与液流垂直的方向迁移．每种蛋白质的侧移距离与它的泳动率、电场强度及它在分离腔中的保留时间成正比。在分离腔出口处,混合物中各种蛋白质根据它们的泳动率被分配在各股液流中并由腔体出口处的一组收集管收集。但是有许多次级现象能损害连续自由流电泳的分离结果,诸如沉降效应、电渗流、焦尔热和自然对流。本文报道了仪器的研和我们对模型蛋白分离条件进行了优化,并成功地将人和兔的红细胞分开。     

表面改性的纳米Fe3O4颗粒用于抗血清快速分离纯化

采用硅烷化试剂Si(OC2H5)3C3H6NH2(APTES)对纳米Fe3O4颗粒表面进行氨基化改性后, 考察了不同浓度偶联剂戊二醛对于颗粒表面固定牛血清白蛋白(BSA)量的影响。此超顺磁性免疫铁颗粒(SPIO)加入兔抗BSA血清中特异性结合BSA抗体后, 用Gly-HCl缓冲液洗脱得到IgG。结果表明当戊二醛浓度大于10%时, 单位颗粒固定蛋白的量达到最大值约140 mg/mg, 10 min, 15 mg的SPIO即可将1 mL抗血清完全分离, 经过两次快速洗脱, 颗粒表面吸附的抗体即可得到纯化; 琼脂扩散实验表明分离后的抗体仍保持较高活性, SDS-PAGE电泳结果表明用此方法纯化后的兔抗BSA IgG纯度大于99%, 比传统的(NH4)2SO4法有了较大提高, 但纯化量并没有减少; SPIO在经过五次重复利用后仍能保持78%以上的分离效果。     

高速逆流色谱分离纯化雷公藤中的雷公藤红素

以雷公藤植物粗提物为原料,建立了高速逆流色谱分离纯化雷公藤红素的分离纯化方法。优化了两相溶剂体系的组成及配比。优化后的分离纯化溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水,其体积之比为2∶3∶3∶2(上相为固定相,下相为流动相),实验温度为室温,主机转速为800 rpm,正向洗脱,流动相流速为2.0 m L/min。目标产物的分离时间较短、产品纯度高(97.5%)、分离过程稳定。     

包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展

重组蛋白在大肠杆菌中表达多为无活性的包涵体形式,须经洗涤、溶解、复性后才能得到生物活性蛋白。综述了近年来包涵体蛋白分离纯化和复性技术研究进展,重点讨论了色谱法复性技术的应用,包括尺寸排阻色谱、亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化脂质体色谱、扩张床吸附色谱的进展情况。     

用疏水色谱法复性并同时纯化重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

目的：建立一种简单、快速复性并同时纯化大肠杆菌表达的重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）的方法。方法：研究rhGM-CSF在疏水色谱（HIC）上的复性和纯化机理,并对固定相和流动相进行选择和优化,包括固定相配基、流动相中盐的种类、流动相pH值、流动相中还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比例,以及流动相中尿素的浓度。结果：优化后的固定相为PEG600,流动相中的盐为（NH4）2SO4,流动相pH值为7．0,流动相中添加2．0mol／L尿素、1．8mmol／LGSH和0-3mmol／LGSSG。在优化条件下,HIC可使rhGM-CSF在分离纯化的同时得到复性,比活达1．58×10^7U／mg,纯度为95．7％,质量回收率为56．8％。结论：建立的疏水色谱复性和纯化工艺可简化操作步骤,缩短生产周期。     

家蝇天然抗菌肽的分离纯化与活性分析

目的:纯化得到有抗菌活性的家蝇天然抗菌肽。方法:以革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的混合菌液,在未灭活的情况下对家蝇幼虫实施带菌针刺以诱导抗菌肽的大量表达。采用固相萃取(SPE),得到三个对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有强烈抑制作用的组分Sp1、Sp3和Sp8。用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对活性最强的Sp1进行了纯化,液体生长抑制法证明其中的组分Ⅲ具有最强活性。毛细管电泳(CE)显示该组分由两种物质组成。结果和结论:家蝇血淋巴中存在大量有抗菌活性的物质。该研究利用SPE和RP-HPLC与CE联用的方法,得到了有较强抗菌活性和较宽抗菌谱的粗提物,并获得一个推测由两种阳离子型抗菌肽组成的成分,为后期研究打下了基础。