人表皮细胞分离培养的研究

目的探索来源于人的表皮细胞的分离培养方法,为其进一步作为皮肤组织工程中的种子细胞或临床应用奠定前期研究基础。方法取3~9岁健康儿童包皮环切术后包皮,经分离酶处理分离真表皮,再将表皮以胰蛋白酶消化为细胞悬液,分别接种于有血清培养基DMEM和无血清培养基K-SFM中进行细胞培养,观察表皮细胞生长融合情况及克隆形成率。结果表皮细胞在DMEM和K-SFM培养液中均能融合成片,但在K-SFM中的融合成片时间明显短于在DMEM中所需时间;在K-SFM中2周时克隆形成率显著高于在DMEM中的克隆形成率。结论两步酶法分离表皮细胞接种于K-SFM中培养,是一种简便有效的表皮细胞分离培养方法。     

分离和克隆小鼠ES细胞集落的主要影响因素

目的　研究不同培养条件分离和克隆小鼠ES细胞集落的效率。方法　以PMEF饲养层、NIH3T3细胞饲养层或培养液中加入LIF为培养条件 ,分离和克隆昆明小鼠ES细胞集落 ,比较其效率。结果　饲养层的培养条件明显优于培养液中加入LIF的培养条件 ;有饲养层的培养条件下 ,桑椹胚的ES细胞集落出现率显著低于囊胚 ;两种饲养层培养囊胚 ,其ES细胞集落的出现率差异无显著性。结论　以PMEF或NIH3T3细胞作饲养层 ,培养昆明小鼠的囊胚 ,适时离散ICM ,是比较理想的分离ES细胞集落的方法。     

潮霉素抗性3T3细胞的建立和鉴定

目的　建立具有潮霉素 (hygromycin)抗性的 3T3细胞系 ,用于转染目的基因 (pTRE Ins human)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因的质粒pHyg导入 3T3细胞中 ,利用潮霉素的药物选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行PCR鉴定。结果　经 5 0 0 μg ml的潮霉素压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性 3T3细胞的形态和生长速度与正常 3T3细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了潮霉素抗性的 3T3细胞 ,为进行目的基因 (pTRE Ins human)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础。     

饲养层细胞对绵羊胚胎干细胞体外培养的影响

家畜胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)的研究进展缓慢,绵羊ES细胞的研究虽早有报道,但仍未建立可稳定传代的细胞系。在已建立的绵羊体外受精发育体系的基础上,摸索了饲养层(Feeder)细胞对绵羊ES细胞生长的影响,包括在一定的丝裂霉素浓度下处理Feeder的时间、细胞种类、代数、接种密度及新鲜制备和冷冻复苏后的Feeder细胞,通过试验比较研究,目的在于筛选合适的饲养层细胞,为建立绵羊ES细胞体外培养体系奠定基础。结果表明,10μg/ml丝裂霉素C处理2~2.5h获得的1~5代的SEF和1~3代的MEF及两者的1∶1混合细胞都能较好地支持绵羊ES细胞的生长。     

用NAG酶活性荧光测定法检测3T3细胞增殖及其应用

设计采用NAG酶活性荧光测定法检测3T3细胞增殖,本实验确立了检测3T3细胞NAG酶活性的一些实验条件,并将该方法用于bFGF的生物活性鉴定。结果:(1)3T3细胞数目在10~3-1.5×10~5之间与NAG酶活性成直线关系,且检测下限细胞数目低达10~3个细胞,表明该方法灵敏度高。(2)接种3T3细胞密度以10~3-1.5×10~3/孔(96孔培养板)为宜。(3)维持3T3细胞正常成活的最适血清浓度为0.4％—0.8％。(4)检测3T3细胞NAG酶活性以样品刺激培养48h为宜。(5)bFGF样品与标准品一样能促进3T3细胞增殖,但bFGF样品生物活性较bFGF标准品差。结论:NAG酶活性测定法能用来检测3T3细胞增殖,该方 法优于以往的细胞计数法、~3H—TdR参入法。     

小鼠前成骨细胞MC3T3-E1在自组装多肽水凝胶支架中的成骨分化

目的研究MC3T3-E1细胞在自组装多肽水凝胶支架上的生长和成骨分化.方法在多肽水凝胶支架RADA16上接种MC3T3-E1细胞,荧光染色观察细胞形态和存活情况;组织化学染色检测MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性以及细胞外钙质沉积;RT-PCR分析成骨特异性基因的表达.结果 MC3T3-E1细胞在水凝胶支架RADA16上粘附铺展良好,呈纺锤样形态.诱导培养后支架上的细胞有较高水平的碱性磷酸酶表达和矿化基质沉积.此外,骨分化特异性基因骨桥蛋白和骨涎蛋白也有表达,且表达量随培养时间的延长而增多.结论 在自组装水凝胶内MC3T3-E1细胞可向成骨方向分化,并能在凝胶内产生矿化的细胞外基质.     

具潮霉素B抗性的NIH3T3细胞饲养层的制备

[目的]建立具有潮霉素B(hygromycinB)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE2-human-Ins)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。[方法]通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因(hyg)的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和southernblot鉴定。[结果]经300ug/ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞。[结论]本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。     

细胞工厂在轮状病毒基因重配株LD9培养中的应用初探

为了探索用细胞工厂代替转瓶培养轮状病毒基因重配株LD9及收获高滴度的LD9病毒原液和提高产量的可行性,分别在2层4、层细胞工厂和3L1、5L转瓶培养Vero细胞,比较两种容器内细胞的生长状态。结果显示,以相同活细胞数2.5×104/ml同时接种两种不同培养容器时,细胞工厂培养3d已长成单层,而转瓶培养需5d;对两种容器长满单层时的细胞经胰酶消化后通过细胞仪计数、分析,结果显示,两种容器培养细胞长成单层时的单位面积细胞密度相当;对长成致密单层细胞的两种容器以相同的MOI(MOI=0.1)接种LD9病毒,转瓶培养的病毒于第8d病毒滴度达到高峰,为6.0～6.5 lgCCID50/ml;细胞工厂第5d病毒滴度达高峰,为6.5 lgCCID50/ml,并于第9d病毒滴度再次达到峰值,为6.0～6.5 lgCCID50/ml,实现二次收获病毒。     

Nogo A和srGAP蛋白在NIH 3T3细胞中的共表达

为检测Nogo A和srGAPs蛋白在NIH 3T3细胞上的表达,应用Western印迹的方法检测Nogo A蛋白的表达. 从NIH 3T3细胞抽提物中检测到约230 kD特异性的Nogo A反应条带;利用双重免疫细胞荧光化学标记法和激光共聚焦显微镜成像技术分别检测Nogo A与srGAPs或Rho蛋白在NIH 3T3细胞上的共表达状况,可观察到Nogo A与srGAPs共存于3T3细胞的细胞浆、突起和生长锥样结构上,亦可观察到Nogo A与Rho蛋白的共存.结果表明,NIH 3T3细胞中共表达Nogo A、srGAPs和Rho分子. 这为研究Nogo A与Rho信号转导途径间的关系奠定了基础.     

体外培养所形成的细胞外基质对MC3T3-E1细胞生长和分化的影响

细胞外基对组织细胞起支持、保护、营养作用,对细胞的增殖、分化有重要影响,在细胞和组织工程中,应该充分考虑细胞外基质的作用。本研究首先脱去培养板中融合培养的原代小鼠心肌成纤维细胞和成骨细胞,获得两种体外形成的细胞外基质包被的培养板,其中成骨细胞细胞外基质中含有骨形成蛋白2。然后将MC3T3-E1成骨前体细胞接种在这种培养板中,发现成纤维细胞胞外基质包被的培养板中的细胞增殖活性最高,而成骨细胞胞外基质包被的培养板中细胞的碱性磷酸酶活性、骨形成蛋白2和骨桥蛋白的相对蛋白表达量最高,细胞外钙沉积量比其他组高1倍左右。结果表明：包被在培养板上的这两种细胞外基质有不同的生物活性,成纤维细胞胞外基质可促进成骨前体细胞增殖,成骨细胞胞外基质可促进成骨前体细胞骨向分化。     

Na2CO3胁迫对星星草叶肉细胞超微结构的影响

利用透射电镜技术对Na2CO3胁迫下星星草叶肉细胞超微结构进行了观察。结果表明：未胁迫的叶肉细胞排列疏松,各种细胞器结构完整,叶绿体含少量淀粉粒和脂质球。轻度盐胁迫（2g/L,4g／LNa2CO3）对叶肉细胞超微结构影响较小。中度盐胁迫（6g／L,8g／L Na2CO3）引起叶肉细胞超微结构的变化,叶绿体类囊体肿胀,基粒紊乱,不含淀粉粒,脂质球数量增加,叶绿体由原来的梭形或椭球形变成圆球状;部分线粒体嵴消失,出现晶体结构;中央大液泡破裂;核逐渐降解。高度盐胁迫（10g／L,12g／LNa2CO3）下,叶绿体片层结构消失,脂质球数量增加,体积变大,被大量的膜片层所包围,叶绿体内、外膜消失,叶肉细胞中看不到叶绿体的存在;膜片层包围线粒体;叶肉细胞中可见大量的泡状结构和膜片层,叶肉细胞死亡。上述结果表明,细胞器特别是叶绿体膜结构的破坏与盐胁迫叶肉细胞最终死亡密切相关。     

细胞工厂培养轮状病毒基因重配株Ls(G3型)条件的优化研究

目的以细胞工厂代替转瓶培养轮状病毒基因重配株Ls的可行性研究。方法采用细胞工厂与相应的转瓶培养工艺作对比,比较两种容器内细胞生长状态与病毒收获液滴度,并对细胞工厂培养条件进行了优化。结果以相同浓度接种细胞时,细胞工厂4 d长成单层,转瓶却需要7 d,经细胞仪计数后单位面积内细胞密度相当;以相同MOI接种病毒后,转瓶内的病毒于第7天病毒滴度达到峰值,细胞已完全脱落;细胞工厂于第3天病毒滴度达到峰值,并实现了3次收获。细胞工厂每次收获的病毒液滴度都稳定在一定范围,与转瓶相当。另外,细胞工厂培养条件优化结果表明,Vero细胞最佳接种浓度为3.0×104细胞/cm2,接种病毒的最适MOI为0.02~0.04。结论使用细胞工厂培养Ls株病毒不仅提高了效率,而且减少了培养空间,可替代转瓶规模化生产轮状病毒疫苗。     

Sertoli细胞饲养层对小鼠精原干细胞增殖的影响

摘要 目的 以小鼠睾丸支持细胞(Sertoli)为饲养层,小鼠胚胎成纤维细胞(STO) 饲养层做对照,研究它对小鼠精原干细胞增殖的影响。方法 用无血清StemPro-34 SFM培养基培养2～5日龄小鼠精原干细胞,分别用相差显微镜观察,免疫组化法研究Sertoli饲养层对精原干细胞生物学行为的影响。结果 发现精原干细胞在Sertoli及STO两种饲养层上的一周内的生物学行为非常相似,但培养1周后,Sertoli细胞作饲养层的培养体系中保留的精原干细胞要比对照组明显增多,约有30%的精原干细胞能存活下来并能维持存活到60d以上。结论 Sertoli细胞作饲养层明显促进精原干细胞的更新增殖。     

轮状病毒LH9株在Vero细胞中的培养条件优化研究

为优化轮状病毒株在Vero细胞上的培养条件,将轮状病毒基因重配株LH9按0.1MOI分别接种于不同规格的细胞培养瓶(100ml、2000ml、3L、15L)。病毒接种采用吸附与未吸附两种方式、病毒收获采取低温冻融后离心与直接离心两种方法,观察分析对病毒滴度的影响。实验中,用CASY细胞计数仪分析活细胞率,病毒接种后逐日观察细胞病变(CPE)并取样,采用细胞半数感染量测定病毒滴度。结果表明,使用不同规格细胞培养瓶经吸附法培养接种、低温破碎法收获的LH9株病毒滴度高,其中以15L立瓶培养滴度最高(6.0～7.0 logCCID50/ml)。     

拟南芥血红蛋白3的亚细胞定位

拟南芥的血红蛋白3（AtGLB 3）属于截短的血红蛋白。与拟南芥血红蛋白1相比,拟南芥血红蛋白3具有不同的起源、不同的生化特性和结构;但其功能还不清楚。蛋白质的定位与蛋白质的功能息息相关。为深入研究该基因功能,构建了拟南芥血红蛋白3基因与绿色荧光蛋白融合的植物表达载体pUCGFP/AtGLB3。利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白3在细胞中的定位。荧光显微镜检测结果表明,AtGLB3基因表达产物主要定位在细胞膜上。     

pSV—2neo和HPV—Ⅱ DNA共同转染NIH3T3细胞的结果

本实验将neo及HPV-11两种DNA共同转染NIH 3T3细胞,以G418抗生素作为选择剂,对诱导的转化灶进行筛选。同时还就G418对NIH 3T3细胞的毒性进行了观察。neo单独使用诱导的转化灶数为44.00/1×10~5;neo与HPV-11合用诱导的转化灶数为162.66/1×10~5。由neo转化的细胞含有neo基因,由neo和HPV-11转化的细胞内含有该两种基因。     

人肺癌基因组DNA对NIH／3T3细胞的转化作用

从未用过抗癌细胞毒药物的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的手术标本(鳞状上皮癌)提取癌细胞基因组总DNA。对小鼠成纤维(NIH/3T3)细胞行转染实验。获二轮转化细胞,发现二轮转化率是一轮的2.7倍。在转染过程中转化灶出现的多少,与所用DNA的量有一定关系。 二轮转化细胞能在软琼脂上存活生长,接种裸鼠能长出肿瘤,分离肿瘤组织细胞,体外培养传代存活。表明该二轮转化细胞具有肿瘤细胞的特性。 取一轮、二轮转化细胞和裸鼠肿瘤细胞的DNA分别与放射性~(32)P标记的人体特有的Alu重复序列和ras家族基因探针进行Southern印迹转移和分子杂交。结果在三者细胞的DNA中都见有与Alu杂交的条带。这表明在转染过 程中人体特有的Alu重复序列已整合到转化细胞的基因组中。并确定了转化细胞中的转化基因之一的属性为Ha-ras癌基因。本工作提示吸烟可能是人肺鳞癌发生和Ha-ras活化的重要因素。     

Vero细胞最佳培养体系筛选

为了筛选出适合Vero细胞生长的最佳条件,本研究分别对Vero细胞的培养液、传代比例和接种浓度进行了优化.首先将Vero细胞在不同组合培养液中进行连续3代传代培养,筛选出适宜Vero细胞连续稳定传代的最佳培养液组成.然后分别在不同的传代比例和接种浓度下进行连续3代培养,筛选出适宜Vero细胞连续稳定传代的最佳传代比例和接种浓度.最终结果显示,Vero细胞在1.296%MEM溶液与特级胎牛血清的组合优于其他组合,可满足Vero细胞连续稳定传代.并且在该培养基的培养下,1∶6的传代比例为最适宜Vero细胞的传代比例,3×10^4/cm^2的接种密度为最适宜Vero细胞的接种密度.本研究最终完成了Vero细胞最佳培养体系条件筛选,并证实该条件满足Vero细胞连续稳定传代.     

有核细胞对淋球菌存活力的影响

目的观察不同浓度的淋球菌在有核细胞内外和体外的存活状况。方法白带标本在密闭保湿和开放干燥的环境下,分别在0、12、24、48h接种于巧克力平板,另将淋球菌用生理盐水配成不同浓度的菌液与有核细胞悬液混合培养30min、1h、5h,然后分别取不同时间段的混合培养液接种于巧克力平板。结果在密闭保湿状况下,白带标本中的淋球菌在中量时存活时间长,少量或大量时其存活力相对较低;在干燥状况下,淋球菌存活时间短;在菌量很少（10／ml）时,有核细胞可以吞噬淋球菌而导致淋球菌存活时间减少,但在菌量较多时（大于300／ml）时,有核细胞可以延长淋球菌存活时间。结论温暖湿润环境有利淋球菌存活;有核细胞对淋球菌既具有保护作用又有杀伤作用。     

逆转录病毒载体介导的LacZ基因在NIH-3T3细胞中的稳定表达

精原干细胞(SSCs)介导的转基因技术很可能成为制作转基因动物及治疗雄性不育的一条新途径。为了研究逆转录病毒载体介导法转染体外培养SSCs的可行性,用脂质体介导法将携带LacZ基因的重组逆转录病毒载体pLNCL导入包装细胞PA317,用含G418的培养液筛选得到5株稳定转染的产毒细胞。收集这些克隆的产毒上清,过滤后进行倍比稀释,用NIH-3T3细胞通过X-gal染色测定其浓缩前病毒滴度。结果显示,PA3173培养上清中病毒的浓缩前滴度最高,达1.1×103CFU/mL。再将筛选到的稳定转染的NIH-3T3细胞培养至单层,进行X-gal染色检测β-半乳糖苷酶的表达。结果显示,大多数稳定转染的NIH-3T3细胞均为X-gal ,表明这些细胞成功表达了目的基因LacZ。本研究结果为后期工作中用该载体感染体外培养SSCs奠定了基础。