SARS冠状病毒S受体结合区蛋白片段在杆状病毒载体中的表达及其抗原性研究

目的:利用Bac-to-Bac1杆状病毒系统,在sf9昆虫细胞中表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)的S受体结合区蛋白片段,并对其免疫原性进行研究。方法:将S蛋白的受体结合区基因片段定向克隆至转座载体pFast-Bac1,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,用抗生素平板筛选重组杆粒。脂质体介导重组杆粒转染sf9昆虫细胞,待细胞形态明显改变后收获细胞和培养上清液。利用SARS病人恢复期抗血清做ELISA和Western印迹,分析重组蛋白的抗原性。结果:ELISA和Western印迹表明,在sf9昆虫细胞中表达的SARS-CoVS受体结合区重组蛋白可与SARS病人恢复期抗血清发生特异反应。结论:获得了在昆虫细胞内表达的SARS-CoVS受体结合区重组蛋白,并证明该蛋白有可能用于SARS感染的抗体检测,为SARS-CoV免疫机制及其疫苗的进一步研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白与γ血红蛋白的相互作用

目的:研究SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)与γ血红蛋白的相互作用。方法:利用免疫共沉淀实验验证SARS-CoV N蛋白与γ血红蛋白存在相互作用,并通过Western印迹检测SARS-CoV N蛋白对细胞内γ血红蛋白表达量及稳定性的影响。结果:SARS-CoV N蛋白与γ血红蛋白的相互作用能使SARS-CoV N蛋白抑制γ血红蛋白在293细胞中的泛素化,提高γ血红蛋白在293细胞中的稳定性,从而使γ血红蛋白在细胞内的表达量显著提高。结论:SARS-CoV N蛋白能与γ血红蛋白在细胞内形成复合物,为揭示SARS-CoV在婴幼儿群体中致病率较低的机理提供了实验基础。     

SARS—CoV感染Vero E6细胞诱导细胞凋亡

为了确定SARS冠状病毒(SARS—CoV)感染Vero E6是否引起细胞凋亡,我们利用细胞DNA琼脂糖电泳,感染细胞的间接荧光染色和Hoechst 33258细胞核染色,以及流式细胞仪分析等方法证明了SARS-CoV感染的Veto E6具有典型的凋亡细胞学和生物化学特征。实验证明具有细胞凋亡特征的所有细胞均为处于感染晚期的细胞。表现明显细胞病变(CPE)的细胞大多已经出现核质凝缩或形成凋亡小体进入细胞凋亡的过程。可以断定SARS-CoV感染Vero E6细胞诱发了细胞凋亡。     

SARS-CoV感染Vero E6细胞诱导细胞凋亡

为了确定SARS冠状病毒(SARS-CoV)感染Vero E6是否引起细胞凋亡,我们利用细胞DNA琼脂糖电泳,感染细胞的间接荧光染色和Hoechst 33258细胞核染色,以及流式细胞仪分析等方法证明了SARS-CoV感染的Vero E6具有典型的凋亡细胞学和生物化学特征.实验证明具有细胞凋亡特征的所有细胞均为处于感染晚期的细胞.表现明显细胞病变(CPE)的细胞大多已经出现核质凝缩或形成凋亡小体进入细胞凋亡的过程.可以断定SARS-CoV感染Vero E6细胞诱发了细胞凋亡.     

SARS-CoV的分子生物学研究

SARS-CoV是引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的病原体．更多地了解SARS-CoV的基因组、蛋白结构以及它与其它冠状病毒的关系,将有助于SARS疾病的防治．     

SARS冠状病毒病毒样颗粒疫苗的研究进展

2003年严重急性呼吸综合征(SARS)大流行之后,研究人员为防控SARS冠状病毒(SARS-CoV)的传播研制了多种不同形式的候选疫苗,大多是利用SARS-CoV表面的一种或多种结构蛋白制备的。SARS-CoV病毒样颗粒是具有较好的应用前景的一种候选疫苗,现将其制备方法及免疫原性做简要综述。     

SARS冠状病毒的刺突蛋白

严重急性呼吸系统综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS corona-vims,SARS-CoV)引起的呼吸系统疾病。SARS-CoV的刺突蛋白(spike protein)具有S1和S2两个独特的功能结构域,研究发现两者都是进行疫苗和抗体研究的理想和有效的靶点。对非典疫苗的研究生产非常有价值,对预防和治疗SARS也有重大意义。     

冠状病毒的新成员--SARS-CoV的基因组特性

2003年3月,人类发现一种新的冠状病毒SARS-CoV,这种病毒是非典型性肺炎(SARS)的病原体。SARS-CoV的基因组序列已经由包括中国科学家在内的全世界的科研人员测定完成。该文对国际报道的SARS病源的基因序列进行了收录,阐述了SARS-CoV基因组的基本特性：SARS-CoV的基因组长约28-30kb,与冠状病毒科的基因组长度相符合,其中包括11个编码序列,基因组的组织方式也与其他冠状病毒类似,从表面蛋白(S蛋白)、外膜蛋白(M蛋白)和核蛋白(N蛋白)上看,SARS病毒与其他冠状病毒的对应蛋白进化关系接近。同时发现,在某些区域,SARS病毒的基因序列与其他冠状病毒存在相当大的差异,具有自身比较保守的基因组序列结构。而且氨基酸的序列也与其他冠状病毒有很大程度的不同。基因信息的冗余分析表明,SARS-CoV具有较低的冗余度,即发生变异的可能性比较大。虽然SARS-CoV外表与冠状病毒类似,亲缘关系未超出冠状病毒科界限,但由于蛋白基因与氨基酸的序列与其他冠状病毒有本质不同,因此可能不是其他冠状病毒的变异体,而是一种与冠状病毒类似、但早已独立存在、此前未被人类所认识的新病毒。     

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒N蛋白对甘油三酯和总胆固醇含量的影响

目的:研究严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白对甘油三酯和总胆固醇含量的影响。方法:检测分析144例SARS患者甘油三脂和总胆固醇含量在发病后的变化;将小鼠随机分组,分别注射生理盐水和SARS-CoV N蛋白,连续给药9 d后检测小鼠血清中甘油三酯和总胆固醇含量的变化。结果:SARS患者的甘油三酯和总胆固醇含量随发病时间有升高变化(P0.05),在发病40 d前后甘油三酯和总胆固醇含量超标的病例数占本时间段内的病例数的比例显著高于其他时间段,而且超标的含量也明显升高。SARS-CoV N蛋白使小鼠体重明显高于对照组(P0.05),甘油三酯含量在39和51 d明显高于对照组(P0.05),总胆固醇含量在21和39 d也明显高于对照组(P0.05)。结论:SARS-CoV N蛋白可以升高小鼠的甘油三酯和总胆固醇的含量,其升高最为明显的时间段与SARS患者的甘油三酯和总胆固醇含量升高的时间段基本一致。由此推测,SARS-CoV N蛋白可能是促使SARS患者发病后甘油三酯和总胆固醇含量升高的重要原因。     

SARS-CoV核蛋白和宿主细胞相互作用的初步研究

寻找与SARS-CoV核蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,从而探索SARS-CoV的致病机理。可溶性表达SARS-CoV核蛋白,利用His标签和离子交换层析对表达的蛋白进行了纯化,获得较纯的可溶性核蛋白。再将SPR/BIA技术与MALDI-TOF MS技术结合起来,使用SPR生物传感芯片作为亲和吸附的表面,分别捕获2BS细胞和A549细胞裂解液中与SARS-CoV核蛋白相互作用的细胞蛋白,收集足够量的相互作用蛋白,再利用MALDI-TOF-MS分析获得蛋白的性质。结果鉴定出与SARS-CoV核蛋白相互作用的蛋白:26S蛋白酶调节亚单位S10B(蛋白酶体亚单位p42)(蛋白酶体26S亚单位ATPase 6)(P62333),属于泛素/蛋白酶体系统;目前国内外尚未见类似报道。此研究初步发现了一种与SARS-CoV核蛋白在细胞外相互作用的蛋白,但这种相互作用在SARS-CoV感染及SARS的发生发展中发挥的作用还有待于深入研究和探索。     

狂犬病病毒N基因的杆状病毒表达及鉴定

利用分子克隆的方法,将CVS-11株狂犬病毒N基因片段克隆入杆状病毒穿梭载体Bacmid中,构建出含CVS-11 NP基因重组杆状病毒表达质粒Bacmid-N;脂质体介导Bacmid-N转染Sf9昆虫细胞获得表达CVS-11 NP的重组杆状病毒(AcMNPV-N)。用ELISA、FA、SDS-PAGE和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析,证实CVS-11 NP为胞内表达,且具有天然核蛋白良好的免疫反应性,为进一步研制高效、敏感的狂犬病病毒检测试剂和建立实验室检测方法奠定基础。     

Expression of rice gall dwarf virus outer coat protein gene (<Emphasis Type="Italic">S8</Emphasis>) in insect cells

To obtain the P8 protein of Rice gall dwarf virus (RGDV) with biological activity, its outer coat protein gene S8 was expressed in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells using the baculovirus expression system. The S8 gene was subcloned into the pFastBac™1 vector, to produce the recombinant baculovirus transfer vector pFB-S8. After transformation, pFB-S8 was introduced into the competent cells (E. coli DH10Bac) containing a shuttle vector, Bacmid, generating the recombinant bacmid rbpFB-S8. After being infected by recombinant baculovirus rvpFB-S8 at different multiplicities of infection, Sf9 cells were collected at different times and analyzed by SDS-PAGE, Western blotting and immunofluorescence microscopy. The expression level of the P8 protein was highest between 48–72 h after transfection of Sf9 cells. Immunofluorescence microscopy showed that P8 protein of RGDV formed punctate structures in the cytoplasm of Sf9 cells.     

丙型肝炎病毒RNA多聚酶在昆虫细胞中的表达

ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ基因片段克隆入ＢＡＣ－ＴＯ－ＢＡＣ＾ＴＭ重组杆状病毒表达系统的ｐＦＡＳＴＨＴｃ载体质粒,转化ＤＨ１０ＢＡＣ＾ＴＭ感受态细菌获得重组的Ｂａｃｍｉｄ质粒,将重组Ｂａｃｍｉｄ质粒转染Ｓｆ细胞,获得的重组杆状病毒可表达目的蛋白。免疫印迹和体外活性检测表明,所表达蛋白为ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ蛋白,具有多聚酶活性。     

人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备

旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(RBP4)并检测其免疫原性。将人RBP4基因片段及信号肽SS64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-dual(pFBd)中,获得相应的重组转移质粒;转化大肠杆菌菌株DH10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的Sf9细胞,获得含人RBP4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的Sf9细胞并表达人RBP4蛋白(I-RBP4),通过SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的Sf9细胞制备一批RBP4蛋白,完成SDS、Western blotting的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与E.coli重组人RBP4(E-RBP4)分别免疫家兔。实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确;成功构建重组RBP4-bacmid;人RBP4蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的RBP4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23 kDa,经过计算表达量为100 mg/L;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100 000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10 000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的RBP4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血RBP4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础。     

HCV核心蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性的初步评价

通过逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从丙肝患者的血清中分离出编码完整ＨＣＶ核心蛋白（Ｃ区）的ｃＤＮＡ片段,并将其克隆到杆状病毒转移质粒中。重组转移质粒ＤＮＡ与线性的杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经蚀斑筛选获得了带编码全部核心蛋白基因的重组杆状病毒。重组病毒感染细胞后表达ＨＣＶ核心蛋白,其分子量的为２０ｋＤ。免疫印染和酶联免疫实验表明,此重组蛋白能被人ＨＣＶ阳性血清所识别。动物实验表明此重组蛋白能诱导小鼠产生特异性抗体。     

杆状病毒表达系统的改进及IL-6在昆虫细胞内的表达和纯化

使用同源重组方法,在昆虫细胞内将多角体启动子驱动的EGFP表达盒插入杆状病毒穿梭载体Bacmid的p74位相,经5轮空斑纯化获得重组穿梭载体Bacmid-egfp。然后将Bacmid-egfp转化含转座助手质粒的E.coliDH10B,获得受体菌E.coliDH10Bac-egfp,由于Bacmid-egfp保留了完整的转座结构和α互补功能,因此该菌株和原始E.coliDH10Bac一样能有效的利用各种pFastBac系列的载体进行转座并构建出能指示病毒繁殖和目的基因表达的重组病毒。使用红色荧光蛋白DsRed对系统进行了验证,结果表明重组病毒Bac-egfp-DsRed感染的细胞中绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白均得到了高效表达。进一步使用该系统在昆虫细胞中高效表达并纯化了IL-6蛋白,为研究和应用该细胞因子提供物质基础,同时也进一步证明所改造的杆状病毒表达系统的可靠性和实用性。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在Sf9细胞中表达真菌细胞色素P450nor

利用BactoBac杆状病毒载体表达系统将真菌细胞色素P450nor基因克隆至转移载体pFastBac1中, 得到重组质粒pFastBacP450nor, 再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中发生转座作用, 得到含P450nor基因的重组穿梭载体rBacmid pAcP450nor。分离提取重组Bacmid DNA, 并转染培养的昆虫细胞Sf9, 得到重组病毒rAcp450nor。经酶切和PCR 鉴定, 细胞色素P450nor基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下, SDSPAGE分析证明：表达蛋白的分子量为43kD左右。Western blotting分析结果表明：有一条特定的杂交带存在, 且分子量相同（约43kD）。进一步证明了含有真菌细胞色素P450nor基因的重组表达载体和重组病毒构建成功,并在昆虫细胞Sf9中实现了高效表达, 经MTT法测定表达的细胞色素P450nor具有还原NO的生物学活性。     

庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用ＰＣＲ扩增出ＨＧＶＥ２全基因,克隆进杆状病毒表达载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴａ中,构建成重组转座载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＥ２,转化ＤＨ１０ＢＡＣ大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒ＤＮＡ,获得含ＨＧＶＥ２基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Ｓｆ９细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Ｓｆ９单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Ｓｆ９细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行１２％ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ＥＬＩＳＡ方法检测各类血清标本,初步研究ＨＧＶＥ２糖蛋白的抗原性     

Expression of Rice Gall Dwarf Virus Outer Coat Protein Gene (S8) in Insect Cells

To obtain the P8 protein of Rice gall dwarf virus (RGDV) with biological activity,its outer coat protein gene S8 was expressed in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells using the baculovirus expression system.The S8 gene was subcloned into the pFastBacTM1 vector,to produce the recombinant baculovirus transfer vector pFB-S8.After transformation,pFB-S8 was introduced into the competent cells (E.coli DH10Bac) containing a shuttle vector,Bacmid,generating the recombinant bacmid rbpFB-S8.After being infected b...     

HIV—1核蛋白p24在昆虫细胞中的表达

将完整的ＨＩＶ－１ ｐ２４基因克隆到杆状病毒转移质粒中,使用重组转移质粒与野生型杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经筛选获得带有编码ｐ２４基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Ｓｆ９细胞后在细胞中表达了ＨＩＶ核蛋白ｐ２４。其重组蛋白的分子量为２４ｋＤ。此重组糖蛋白在免疫荧光,免疫印染和酶联免疫实验中都能被人ＨＩＶ－１阳性血清和单克隆抗体所识别。