Cu/Zn-SOD基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

为研究Cu/Zn-SOD基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用,从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)中克隆得到Cu/Zn-SOD基因,以pZP211质粒为表达载体,构建了植物表达载体pZP211-Cu/ZnSOD,并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化.经PCR检测证明已获得转Cu/Zn-SOD基因的烟草.进而测定转基因烟草的SOD活力,结果表明Cu/Zn-SOD基因在烟草中高效表达.对转基因烟草进行耐盐性检测,证明Cu/Zn-SOD基因确实能够提高烟草对盐胁迫的耐受性.     

烟草质体多顺反子定点整合表达载体的构建和转化

构建了烟草质体多顺反子定点整合表达载体pLM4(-psaA-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3'-psbC-).用基因枪将该载体轰击烟草叶片5次,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草6株.用PCR、激光扫描、Western blot和RFLP等方法检测都证实多顺反子表达盒中的3个基因甘露聚糖酶基因(man)、绿荧光蛋白基因(gfp)、氨基糖苷3'-腺苷酰基转移酶基因(aadA)已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达.     

北非蝎昆虫毒素AaHIT1基因的原核表达和转基因分析

将北非蝎昆虫毒素 (AndroctonusaustralisHectorinsecttoxin ,AaHIT1)基因克隆入温度诱导表达载体pBV2 2 0 ,并在宿主菌E .coliDH5α中进行诱导表达 .表达定位分析发现 ,AaHIT1大部分存在于包涵体中 .蛋白质N 端测序证实了体外表达的AaHIT1蛋白的正确性 .将AaHIT1基因转化入烟草中并获得了转基因植株 ,基因组PCR、RT PCR及Northern印迹分别证实AaHIT1基因已正确地插入到烟草基因组中并已得到表达 .抗虫实验表明 ,该转基因烟草对白粉虱有明显的抗性 .该研究为蝎毒AaHIT1的生物学毒性实验以及获得抗虫转基因作物奠定了基础     

金花茶查尔酮合成酶基因CnCHS的克隆及遗传转化研究

根据已发表的金花茶查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因(CnCHS)序列设计全长扩增引物,以金花茶花瓣总cDNA为模板进行PCR扩增,成功获得了该基因cDNA全长。将扩增所得全长产物连接PMD18-T载体后转化大肠杆菌E.coli DH5α,提取质粒后经酶切、测序鉴定后,将其与双元表达载体pCAMBIA1300连接,成功构建了CnCHS基因的正义表达载体pCAM-CnCHS。将该重组表达载体转化农杆菌EHA105后,利用农杆菌介导法将CnCHS基因转入烟草,获得转基因烟草18株。利用PCR法及Southern blotting对所获得的转基因植株进行鉴定,结果显示CnCHS基因成功整合到烟草基因组中,阳性率达67%,并获得了单拷贝转基因植株。这些结果表明本研究成功构建了金花茶CnCHS基因对烟草的遗传转化体系,为深入研究CnCHS基因的功能及其对花色的调控效应奠定了基础。     

FMDV vp1基因在烟草中表达及转基因烟草的免疫效果

通过三亲杂交法,构建克隆有阿克苏(Akesu/58)O型口蹄疫病毒vp1基因的双元表达载体pBin FMDV VP1.采用农杆菌介导法转化NC89烟草叶盘,经卡那霉素筛选,共获得49株抗性植株.对抗性植株总DNA进行目的基因的PCR检测,有40株阳性植株.对阳性植株总RNA进行目的基因的RT-PCR检测,有21株阳性植株.将7株ELISA和Western-blot检测阳性植株叶片提取物分别与弗氏佐剂乳化,在0、15、30和45d腹膜腔接种Balb/C小白鼠,于第4次免疫后第9d进行血清抗体检测;第12d用10 4SM\-\{50\}LD的同源强毒进行攻击;攻毒后24h采血,通过乳鼠病毒血症试验判定攻击Balb/C小白鼠的发病和保护情况.结果表明双元表达载体pBin FMDV VP1构建正确;vp1基因转入NC89烟草并获得表达;7组中有2组Balb/C小白鼠血清抗体呈阳性,攻毒保护率分别为100%和63%.证明2株转基因烟草表达的VP1蛋白具有较好的免疫原性,所免疫的2组Balb/C小白鼠对同源强毒攻击有一定的抵抗能力.     

华南象草PpCAD基因的亚细胞定位及其在转基因烟草中的异源表达

该研究根据已克隆的华南象草(Pennisetum purpureum cv.Huanan)肉桂醇脱氢酶(CAD)基因PpCAD的cDNA序列,构建亚细胞定位载体pAN580-PpCAD,用PEG介导法转化象草原生质体,以探究PpCAD蛋白在细胞内的定位;同时构建植物过表达载体pBA002-PpCAD,通过农杆菌介导法在烟草中异源表达,以研究PpCAD基因与植物木质素合成的关系。结果显示:(1)PpCAD定位在象草原生质体的细胞质内;(2)过表达载体pBA002-PpCAD转化烟草后获得27株转基因烟草,其中25株PCR鉴定为阳性;(3)半定量RT-PCR检测6株转基因烟草后发现,PpCAD基因在不同植株的表达量存在差异,通过Southern杂交检测后发现该差异与目的基因插入的拷贝数有关;(4)6株转基因烟草和野生型烟草表型上没有明显差异,除目的基因多拷贝插入的植株OEC6外,木质素含量有不同程度的提高,最高比野生型提高了56.50%。研究表明,PpCAD是一个细胞质蛋白,在烟草中过表达PpCAD能够提高植株木质素含量,表明PpCAD基因参与了植物的木质素合成,可用于象草的木质素调控研究。     

金属硫蛋白突变体的植物高效表达载体的构建及其在烟草中的表达

金属硫蛋白有α、β两个结构域（ｄｏｍ ａｉｎ）,其中α结构域优先结合Ｃｄ２＋ 和Ｈｇ２＋ ．小鼠αα突变体在大肠杆菌中已经构建并得到表达,其转基因植株已得到,可在Ｃｄ３００（３００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．为了进一步提高外源基因在烟草中的表达量,首先用ＰＣＲ 的方法设计引物,在基因翻译起始密码子ＡＴＧ 附近加入植物偏爱的碱基组合ＡＡＣＡＡＴＧ．另外,将该突变体基因插入具有双３５ Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）强启动子的植物双元表达载体ｐＧＰＴＶｄ３５Ｓ－ＢＡＲ中,获得了带有αα突变体的植物双元表达载体．通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草ＮＣ８９,获得了抗除草剂的转基因植株．经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 和蛋白Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测,证明了αα突变体在烟草中的嵌合与表达．抗重金属实验证明转基因烟草可以在Ｃｄ４００（４００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．     

FMDV vp1基因在烟草中表达及转基因烟草的免疫效果

通过三亲杂交法,构建克隆有阿克苏(Akesu/58) O 型口蹄疫病毒vp1 基因的双元表达载体pBin FMDVVP1。采用农杆菌介导法转化NC89烟草叶盘,经卡那霉素筛选,共获得49株抗性植株。对抗性植株总DNA进行目的基因的PCR检测,有40株阳性植株。对阳性植株总RNA进行目的基因的RT PCR检测,有21株阳性植株。将7株ELISA和Western blot检测阳性植株叶片提取物分别与弗氏佐剂乳化,在0、15、30 和45d 腹膜腔接种Balb/C小白鼠,于第4次免疫后第9d进行血清抗体检测;第12d用104SM50 LD的同源强毒进行攻击;攻毒后24h采血,通过乳鼠病毒血症试验判定攻击Balb/C小白鼠的发病和保护情况。结果表明:双元表达载体pBin FMDVVP1构建正确;vp1基因转入NC89烟草并获得表达;7组中有2组Balb/C小白鼠血清抗体呈阳性,攻毒保护率分别为100%和63%。证明2株转基因烟草表达的VP1蛋白具有较好的免疫原性,所免疫的2 组Balb/C小白鼠对同源强毒攻击有一定的抵抗能力。     

陆地棉超氧化物歧化酶基因的克隆与烟草转化

以陆地棉‘中棉所36’和烟草‘NC89’为材料,采用RT-PCR方法,从陆地棉中克隆到了Cu/Zn-SOD的cD-NA编码区,经植物表达载体pBI-SOD,导入根癌农杆菌LBA4404,对烟草叶片进行遗传转化,经卡那霉素筛选,获得正确的Cu/Zn-SOD的cDNA编码区,构建了转基因载体,并成功地获得2株转基因烟草;经PCR、Southern blotting和SOD酶活性等检测,证明Cu/Zn-SOD基因已经整合到烟草的基因组并表达。本试验结果为转基因棉花的进一步研究奠定了基础。     

NtSKP1基因的反义载体构建及转基因烟草的产生

根据枯斑三生烟SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计一对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,扩增目的基因(约473bp)片段。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL的内含子右侧,再经NotⅠ酶切回收约3443bp的目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段反向序列的植物表达载体pART27-skp1a,其转录产物能减弱目的基因的表达。将pART27-skp1a质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。     

大白菜orf224基因植物表达载体的构建及遗传转化

为了创制新的大白菜雄性不育材料,双酶切重组质粒pMD18-T-CMS7311-orf224和表达载体pWR306后,将CMS7311-orf224基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因CMS7311-orf224的植物表达载体pWR-CMS7311-orf224,通过酶切和PCR验证pWR-CMS7311-orf224载体构建正确.采用快速冻融法,将表达载体导入农杆菌EHA105,转化大白菜材料06J28,对转化植株的GUS、PCR和RT-PCR检测表明,获得了2个大白菜转基因植株.     

蓖麻毒蛋白A链基因RNAi转化研究

通过基因沉默技术调控蓖麻毒蛋白A链基因的表达,以期获得低毒蓖麻新材料.利用基因克隆技术获得蓖麻毒蛋白A链基因762 bp片段,命名为RTA基因.进一步利用该基因构建了植物RNAi表达载体pBI-RTA-S-AS,通过农杆菌介导法转化蓖麻子叶节,用卡那抗性筛选转化再生植株,PCR进一步鉴定转基因植株.结果表明:克隆得到目的基因长762 bp,与预期结果一致;卡那抗性筛选和PCR鉴定结果显示,获得了3株转基因阳性植株.     

病毒诱导烟草的基因沉默

病毒诱导基因沉默是利用RNA介导病毒防卫机制的一项技术。构建含有目的基因片段的人工改造病毒载体,通过农杆菌侵染导致植物内源目的基因沉默。为建立病毒诱导基因沉默体系,选用烟草脆裂病毒（TRV）和烟草为实验材料。构建了八氢番茄红素去饱和酶基因（PDS）的基因沉默病毒载体,病毒载体侵染结果显示目的基因PDS沉默导致烟草幼苗出现光漂白现象。采用RT-PCR的方法检测目的基因PDS的沉默效果,结果显示PDS基因mRNA被显著降解。该体系的建市有利于将来对植物基因进行高通量功能分析。     

种子特异性启动子（napinB promoter）分离，表达载体构建及转基因植物获得

利用PCR技术从油菜Brassica napus H165基因组DNA中分离了napinB启动子,序列分析表明,扩增片段（nap300)与文献报道的napinB启动子相应区域的同源性为97％,将其与gus连接构建种子特异性表达载体,农杆菌介导转化烟草,PCR,Southern结果显示,nap300已整合到烟草基因组DNA,获得了转基因植株。     

马哈利樱桃PGIP cDNA克隆序列分析

以马哈利樱桃（Prunus mahaleb L.）为材料,通过RT－PCR获得了1045bp的目的段,经克隆测序,证实该片段包含1个完整的开放阅读框架,该阅读框架由990碱基组成,编码330个氨基酸。该序列与杏、梨、苹果的PGIP cDNA序列同源性分别达97.2%、83.4%和83.6%,可能编码的氨基酸与杏、梨、苹果的PGIP cDNA所编码的氨基酸的同源性分别达到96.7%、85.2%和85.2%。与已经克隆的PGIP DNA序列的对比分析表明,PGIP DNA序列中包含2个外显子和1个内含子,内含子全长147 ,符合TG－AG规律,2个外显子长度分别为581bp、464bp。     

拟南芥冷诱导型启动子CBF 3的克隆及活性检测

目的：构建冷诱导型启动子CBF3基因的植物表达载体,并将其转入烟草。方法：以拟南芥基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆冷诱导表达启动子CBF3（C-repeat binding factor）。用CBF3启动子替换pBI121载体上的35S启动子构建新的载体pBC-GUS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草。结果：获得了转基因烟草,转基因烟草的GUS组织化学染色及PCR分析结果表明,在低温诱导下,CBF3启动子可增强GUS基因表达。结论：CBF3启动子可应用于植物抗冷基因工程研究。     

芍药乙烯受体PlETR1基因过表达载体的构建及烟草转化

芍药是乙烯敏感型花卉,乙烯受体感知并传导乙烯信号,在乙烯信号转导途径中发挥重要作用。芍药PlETR1基因cDNA全长序列已分离,为了鉴定芍药PlETR1基因的功能,本研究基于PlETR1基因和表达载体序列,应用Primer Premier 5.0软件设计了一对特异性PCR引物,采用RT-PCR技术扩增出了PlETR1编码区片段,进一步构建了芍药PlETR1基因过表达载体。基于优化的模式植物烟草的组培体系和筛选出的潮霉素抗性浓度,应用农杆菌介导的叶盘法开展了芍药PlETR1基因转化烟草的研究,对转基因抗性烟草植株进行了PCR检测,结果表明HPT基因和芍药PlETR1基因已导入到烟草基因组中,且芍药PlETR1基因转录表达成功,为下一步鉴定芍药PlETR1基因的功能提供科学依据。     

A removable virus vector suitable for plant genome editing

Plant genome editing is achieved by the expression of sequence‐specific nucleases (SSNs). RNA virus vector‐mediated expression of SSNs is a promising approach for transgene integration‐free targeted mutagenesis in plants. However, the removal of virus vectors from infected plants is challenging because no antiviral drugs are available against plant viruses. Here, we developed a removable RNA virus vector that carries the target site of tobacco microRNA398 (miR398) whose expression is induced during shoot regeneration. In the inoculated leaves in which expression of miR398 is not induced, insertion of the miR398 target site did not affect the practicability of the virus vector. When shoots were regenerated from the infected leaves, miR398 was expressed and viral RNA was eliminated. The virus vector successfully expressed SSNs in inoculated leaves, from which virus‐free genome‐edited plants were regenerated via tissue culture.     

红豆越桔VviDREB1基因转化烟草的研究

通过构建pVB4215植物双元表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草,研究VviDREB1在植物体中的异源表达特性.结果显示,实验获得了25个Hyg抗性株系,经过PCR、RT-PCR和GUS组织化学染色检测及Hyg基因的PCR复检等多点验证,证实表达载体边界内序列完整地整合到2个烟草株系的基因组中.转基因烟草株系在4℃低温处理20 h后,恢复生长5 h,叶片光系统PSⅡ抗寒性分析结果表明,转基因植株的叶片快速叶绿素荧光曲线OJIP各点数值高于对照植株,VviDREB1基因能够显著提高烟草的荧光产量,最大光化学效率Fv/Fm和以吸收光能为基础的性能指数PIABS较对照高,说明VviDREB1对保护植物组织细胞内光合系统PSⅡ有明显的作用,转VviDREB1基因烟草对低温有一定的忍耐能力.