大肠杆菌表达托佩克猪SLA-1胞外区的研究

为构建托佩克猪SLA-1重链基因原核重组表达载体并研究其在pET-21a(+)中的表达,设计引物,PCR扩增托佩克猪SLA-1基因胞外区(命名为SLA-1-TPKe),并克隆至pMD19-T Simple Vector,经酶切鉴定后将SLA-1-TPKe基因与表达系统pET-21a(+)连接,转化到BL21(Rosseta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。提取SLA-1-TPKe包涵体,并经SDSPAGE检测。PCR结果显示,SLA-1-TPKe大小为851 bp,成功克隆到pMD19-T Simple Vector,酶切鉴定大小为831 bp,连接到pET-21a(+)并转化到BL21(Rosseta)菌,经诱导表达和SDS-PAGE检测目的蛋白的大小为31 kD。目的蛋白以包涵体形式存在,纯化后蛋白纯度达到90%以上。     

荷包猪SLA-2重链基因偶合底物肽及表达研究

目的:构建荷包猪SLA-2重链基因偶合底物肽(BSP)并研究其在pET-21a(+)中的蛋白表达.方法:设计荷包猪SLA-2-BSP复合基因引物,PCR扩增荷包猪SLA-2-HB-BSP复合基因,并克隆至pMD(R)19-T Simple Vector,经酶切鉴定后,将SLA-2-HB-BSP复合基因与表达系统pET-21a(+)连接,并转化BL21 (Rosetta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白.结果:PCR结果显示,SLA-2-BSP大小为900bp左右,并成功克隆至pMD(R)19-T Simple Vector载体,酶切后大小为876bp,该基因连接pET-21 a(+)并转化宿主菌BL21(Rosetta)后,经诱导表达和SDS-PAGE检测,目标蛋白大小为34.4kDa,经优化后目的蛋白相对表达含量达到了45％.结论:该研究成功构建荷包猪SLA-2偶合BSP的pET-21a重组表达系,为下一步构建猪SLA Ⅰ类分子四聚体奠定了基础.     

托佩克猪SLA-3原核表达载体构建及表达

目的:研究托佩克猪SLA-3-TPK的原核表达载体的构建及蛋白表达。方法:设计引物扩增SLA-3-TPK胞外区(命名为SLA-3-TPKe),并将此片段克隆至p MD19-T Simple Vector,经双酶切筛选阳性克隆测序,序列正确的克隆片段与表达载体p ET-21a(+)连接,转化宿主菌BL21,并经过诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。结果:PCR成功扩增获得SLA-3-TPke,大小约为850bp,酶切后插入片段大小约为830bp,经克隆测序,阳性克隆序列与原序列一致,双酶切鉴定证实目的基因与p ET-21a(+)成功连接,经过IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测,结果显示目的基因成功表达且目的蛋白大小约为31k Da。结论:该研究成功构建了托佩克猪SLA-3原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。     

烟台黑猪SLA-I重链基因末端生物素修饰及表达

为构建烟台黑猪SLA-2重链基因偶合生物素化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide,BSP)并研究其在pET-28a(+)中的表达,设计烟台黑猪SLA-2-BSP复合基因引物,PCR扩增烟台黑猪SLA-2-YTH-BSP复合基因,并克隆至pMD 19-T Simple Vectorp,经酶切鉴定后将SLA-2-YTH-BSP复合基因与表达系统pET-28a(+)链接,并转化到BL21(Rosseta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。表达蛋白经过Ni-NTA亲和纯化,并经SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。PCR结果显示SLA-2-BSP大小为900 bp,并成功克隆到pMD 19-T Simple Vector,酶切鉴定大小为876 bp,该基因链接到pET-28a(+)并转化到BL21(Rosseta)菌,经诱导表达和SDS-PAGE检测目的蛋白的大小为32.4 kD。目的蛋白以包涵体形式存在,纯化后蛋白纯度达到90%以上。成功构建烟台黑猪SLA-I重链偶合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的pET-28a(+)的重组表达系,为下一步的SLA-I类分子四聚体研究鉴定基础。     

大肠杆菌表达SLA-3蛋白与口蹄疫病毒多肽的复性研究

【目的】研究大约克猪SLA-3(SLA-3-YDY)蛋白在体外与口蹄疫病毒多肽的复性。【方法】设计SLA-3-YDY胞外区引物,PCR扩增目的基因,并将此片段克隆至p MD19-T Simple Vector上,双酶切筛选出阳性克隆并测序,测序正确的片段连接至表达载体p ET-21a(+)上,转化大肠杆菌感受态BL21细胞中,IPTG诱导,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。超声破碎菌体,提取包涵体蛋白,通过稀释复性法将重链SLA-3-YDY、轻链sβ2m和口蹄疫病毒多肽Hu52按摩尔比1:1:1加入复性液,经分子筛层析纯化并检测复合物是否复性。【结果】PCR扩增获得SLA-3-YDY目的基因,经测序阳性克隆序列与原序列一致。经酶切鉴定,证明目的基因与p ET-21a(+)载体成功连接,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测,显示目的基因表达,大小约33 k D,SDS-PAGE检测包涵体蛋白,证明包涵体蛋白大小与菌体蛋白大小一致。分子筛及SDS-PAGE检测发现,通过稀释复性法实现了重链、轻链和多肽的复性,并得到蛋白复合物SLA-3-Hu52-sβ2m(45 k D)。【结论】构建了大约克猪SLA-3原核表达载体,获得目的蛋白,实现了口蹄疫病毒多肽Hu52与SLA-3重链及轻链的复性,为今后进一步研究SLA-3的结构和功能奠定基础。     

乙型脑炎病毒sA14-14-2株NS1基因片段的克隆、测序与表达

以流行性乙型脑炎病毒减弱毒株SA14－14－2的基因组RNA为模板,采用RT－PCR技术扩增其NS1基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,得到克隆质粒pMD18-T-NS1.pMD18-T-NS1经EcoRI和SalI酶切后,回收NS1片段克隆到原核表达载体pET-28a( )EcoRI/SalI位点,构建了重组原核表达质粒pET-28a（＋）－NS1。转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导诱导获得高效表达。产物经SDS－PAGE电泳结果显示,表达产物分子量约为45kD。Western blotting分析表明产物具有抗原活性。     

类球红菌自诱导物合成酶基因cerI的克隆及其原核表达

根据类球红菌(Rhodobacter sphaeroides 2.4.1)自诱导物合成酶基因cerI的序列,设计并合成了1对特异性引物,在引物的5′和3′分别加入含有HindIII和XhoI限制性酶切位点的序列,以类球红细菌Rhodobacter sphaeroides基因组为模板扩增了cerI基因序列.将PCR产物与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α.鉴定成功获得目的片段,经HindIII和XhoI双酶切后与载体pET-28a(+)连接,构建原核表达质粒pET-28a(+)-cerI,并将其转化宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导其表达.SDS-PAGE分析表明,重组载体pET-28a(+)-cerI可成功地在大肠杆菌中表达cerI蛋白.     

类球红菌自诱导物合成酶基因cerⅠ的克隆及其原核表达

根据类球红菌（Rhodobacter sphaeroides2.4.1）自诱导物合成酶基因cerⅠ的序列,设计并合成了1对特异性引物,在引物的5′和3′分别加入含有HindⅢ和XhoⅠ限制性酶切位点的序列,以类球红细菌Rhodobactersphaeroides基因组为模板扩增了cerⅠ基因序列。将PCR产物与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α。鉴定成功获得目的片段,经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后与载体pET-28a（＋）连接,构建原核表达质粒pET-28a（＋）-cerⅠ,并将其转化宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导其表达。SDS-PAGE分析表明,重组载体pET-28a（＋）-cerⅠ可成功地在大肠杆菌中表达cerⅠ蛋白。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

人角质细胞生长因子2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建人角质细胞生长因子2(hKGF2)基因的高效原核表达载体pET-30a( )-hKGF2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达。方法:从培养的人胚胎肺成纤维细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出去除了信号肽部分的hKGF2基因,克隆到pMD18-T载体,经DNA序列分析后与pET-30a( )表达载体连接,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达6×His-hKGF2,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白。结果:构建了表达载体pET-30a( )-hKGF2,经IPTG诱导后,表达的重组蛋白理论相对分子质量约为23000,约占菌体总蛋白的20%。结论:6×His-hKGF2蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中为可溶性高效表达,为获得高纯度、高活性的产物,以及进一步的大规模生产和应用研究奠定了基础。     

人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建

以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒.酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子.重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100％相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带.     

荷包猪SLA-2-HB01真核表达载体的构建及在PK15细胞中的表达

为构建荷包猪SLA-2-HB01真核细胞表达载体,观察其在PK15细胞中的表达情况。首先参考SLA-2-HB01基因编码区序列设计了引物对,以SLA-2-HB01-pMD 18-T为模板PCR扩增获得SLA-2-HB01编码区基因片段,经TA克隆及菌落PCR筛选得到阳性克隆菌。测序正确后大量双酶切回收目的基因片段并与真核表达载体pEGFP N3相连接获得重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,重组质粒转化至大肠杆菌经大量克隆后,抽提阳性重组质粒并通过脂质体介导转染至PK15细胞,通过荧光显微镜观察转染后PK15细胞的荧光强度,进一步通过Western Blotting检测PK15细胞中SLA-2-HB01蛋白的表达情况。结果显示PCR成功扩增得到SLA-2-HB01,大小为1 104 bp,并成功构建重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,酶切鉴定证实插入片段大小为1 092 bp。SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒转染PK15细胞后具有绿色荧光,Western Blotting显示SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白分子量大小为70 kD,与理论值相符。成功构建了SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒,并初步确认SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白成功在PK15细胞中表达,为下一步进行SLA-2-HB01递呈多肽表位的研究奠定基础。     

轮状病毒VP7基因的克隆与表达

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增轮状病毒VP7基因,并将其克隆到pMD18-T simple载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定DNA全序列。结果显示,克隆片段全长为981 bp。将轮状病毒VP7基因定向的克隆到原核表达载体pET-32a启动子下游,构建原核表达载体pET-32aVP7。将质粒pET-32aVP7转化Transetta表达菌株进行诱导表达,裂解菌体细胞抽提蛋白质进行SDS-PAGE。结果表明,轮状病毒壳蛋白VP7基因在Transetta表达菌株内得到成功表达。     

羊传染性脓疱病毒新疆流行株F1L基因克隆及表达

目的:为了探讨F1L重组蛋白作为羊传染性脓疱病毒亚单位疫苗的可行性。方法:以分离出羊传染性脓疱病毒ORFV-shz分离株为模板,扩增F1L基因片段,并将其克隆至pMD18-T载体中进行测序。构建原核表达载体pET-32a-F1L,转化至大肠埃希菌BL21,用SDS-PAGE及Western blot检测目的蛋白的表达情况及其反应原性。结果:PCR扩增出F1L基因全长1023bp,共编码340个氨基酸;推导的氨基酸序列中第1～70位氨基酸构成信号肽序列,第285～313位氨基酸为跨膜区。SDS-PAGE分析表明获得了约57.4kDa的融合蛋白,在Western-blotting检测中,融合蛋白可与羊传染性脓疱病毒阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。结论:成功构建F1L基因的原核表达载体,为研究新疆地区羊传染性脓疱的防治及疫苗开发提供了科学依据。     

DC-SIGN胞外区基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

旨在构建DC-SIGN胞外区基因原核表达质粒,诱导蛋白表达并制备多克隆抗体。用PCR的方法扩增编码DC-SIGN胞外区的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达DC-SIGN胞外区蛋白,用H is抗体做W estern Blotting鉴定目的蛋白的免疫原性。用纯化的DC-SIGN胞外区蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,免疫荧光法检测其特异性。结果显示,原核表达载体pET-28 a(+)-DC-SIGN胞外区基因成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,获得相对分子质量约20 kD的DC-SIGN胞外区蛋白,经Westernb lotting鉴定为正确。纯化后的蛋白免疫大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫原性和特异性。本研究得到了纯化的DC-SIGN胞外区蛋白,并制备了具有特异性和高效价的抗体,为研究DC-SIGN生物学功能提供试验基础。     

细粒棘球蚴FABP基因的原核表达及蛋白鉴定

构建原核表达载体pET-FABP,优化表达条件,采用免疫学方法鉴定纯化的FABP融合蛋白。载体pMD19-T-FABP和pET-44a(+)经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将回收的FABP片段与pET-44a(+)连接,构建原核表达载体pET-FABP并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,优化表达条件,纯化FABP融合蛋白,Western blotting鉴定。成功构建了原核表达载体pET-FABP并在大肠杆菌中高效表达。纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确。构建的表达载体pET-FABP可以在大肠杆菌中大量表达Nus-FABP融合蛋白,为进一步研制FABP亚单位疫苗奠定了基础。     

牛疱疹病毒Ⅰ型ul49(VP22)基因的序列分析及其表达

以牛疱疹病毒I型 (BHV-I) 国内地方分离株感染的细胞培养物制备PCR模板,扩增出大小约0.77kb 的ul49基因完整编码区片段,将扩增片段克隆到pMD18-T载体中,获得含ul49基因的重组质粒pMD-VP22.采用双脱氧末端终止法进行序列测定,发现与国外Cooper株ul49基因序列完全一致,说明ul49基因相当保守.进一步将BHV-I ul49完整编码区片段插入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C1中,获得分别与6xHis融合的原核表达质粒pET-28aVP22和与EGFP融合的真核表达质粒pEGFPVP22.将pET-28aVP22转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测发现在38kDa处有一条特异性的表达带.利用脂质体介导,将pEGFPVP22转染PK-15细胞,经G418加压筛选,获得稳定表达VP22的细胞克隆.在倒置荧光显微镜直接检测未固定的活细胞,发现pEGFPVP22转染细胞能发出很强的荧光并主要集中在细胞核中,而对照载体pEGFP- C1转染细胞的荧光分布于胞浆.     

植物乳杆菌JPP2胆盐水解酶相关基因克隆和表达

通过PCR方法从植物乳杆菌JPP2中扩增出胆盐水解酶（BSH）相关基因bsh3,利用中间克隆载体pMD19-T将其构建于表达载体pET-28b上,并转化入表达宿主菌E．coli BL21（DE3）,成功构建重组BSH的工程菌。核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,正确克隆出目的基因。诱导表达后,SDS-PAGE电泳结果显示出特异性蛋白质条带,其分子量约为38kDa。此单克隆体系的构建为进一步研究BSH的功能奠定基础。     

大黄鱼MSTN成熟肽区基因的原核表达

根据本实验室克隆的大黄鱼肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,通过RT-PCR法扩增大黄鱼MSTN成熟肽区域的基因,将目的片段插入pMD18-T克隆质粒,并测序验证。验证后用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切含目的片段的pMD18-T克隆质粒和pET-28 a表达质粒,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒。将重组表达质粒转化至BL21菌中,经IPTG诱导后表达蛋白的大小约17 kD。     

大肠杆菌glgC基因的克隆及原核表达

以大肠杆菌BL21染色体DNA为模板,根据glgC基因的全序列设计了1对引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了glgC基因片段,测序结果显示该片段大小为1296 bp,编码432个氨基酸残基。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a-c( )中,重组载体pET-glgC转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到了与理论推算的glgC基因表达产物分子质量(约53 kD)相符的特异蛋白条带。