adw与adr亚型乙型肝炎表面抗原基因在哺乳动物细胞中的表达

以pSV2-dhfr DNA为载体,在其单一酶切点Bg1Ⅱ处分别插入adw或adr亚型的HBVDNA Bg1 ⅡA片段(包括完整的pre-s及s基因),构成PSDHB_(r-1)和PSDHBw重组质粒。将其分别与pX1 DNA用磷酸钙沉淀法共转化LTK-细胞,在HAT培基选择压力下,挑选LTK~ 细胞,这些细胞均能有效表达HBsAg。再改用MTX选择培基,并逐渐增加其药量,从MTX抗性细胞中获得稳定表达HBsAg的Mwc-1和Mrm细胞系。     

顺铂诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型的建立

目的：建立常见凋亡诱导剂顺铂（Cisplatin）诱导非洲绿猴肾细胞（Vero）凋亡的模型,为进一步研究抗凋亡基因在细胞凋亡中的分子机理打下基础。方法：分别以不同浓度的顺铂处理Veto细胞48h,用噻唑蓝（MTT）比色法、Gimesa染色、流式细胞术检测,观察处理后细胞的生长活力和凋亡情况。结果：以未处理的细胞作为对照组,1、2、3、4,5μg／mL的顺铂处理的Vero细胞生存率分别为（79．02±6．10）％、（68．84±4．42）％、（56．66±4．07）％、（46．83±3．76）％、（29．04±5．93）％（P〈0．01）;经顺铂诱导后细胞形态学发生明显改变,出现膜小泡和凋亡小体形成等凋亡细胞特征;流式细胞仪检测,0、1、2、3、4、5μg／mL的顺铂处理的Vero细胞后凋亡率分别为1．66％±0．19％、16．65％±1．26％、24．82％±1．03％、36．22％±1．04％、48．49％±1．24％、43．34％±1．17％（P〈0．01）。结论：本实验成功建立顺铂诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型,将有助于进一步探讨目的基因在Vero细胞凋亡作用的的分子机制。     

顺铂诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型的建立

目的:建立常见凋亡诱导剂顺铂(Cisplatin)诱导非洲绿猴肾细胞(Vero)凋亡的模型,为进一步研究抗凋亡基因在细胞凋亡中的分子机理打下基础。方法:分别以不同浓度的顺铂处理Vero细胞48h,用噻唑蓝(MTT)比色法、Gimesa染色、流式细胞术检测,观察处理后细胞的生长活力和凋亡情况。结果:以未处理的细胞作为对照组,1、2、3、4、5μg/mL的顺铂处理的Vero细胞生存率分别为(79.02±6.10)%、(68.84±4.42)%、(56.66±4.07)%、(46.83±3.76)%、(29.04±5.93)%(P<0.01);经顺铂诱导后细胞形态学发生明显改变,出现膜小泡和凋亡小体形成等凋亡细胞特征;流式细胞仪检测,0、1、2、3、4、5μg/mL的顺铂处理的Vero细胞后凋亡率分别为1.66%±0.19%、16.65%±1.26%、24.82%±1.03%、36.22%±1.04%、48.49%±1.24%、43.34%±1.17%(P<0.01)。结论:本实验成功建立顺铂诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型,将有助于进一步探讨目的基因在Vero细胞凋亡作用的的分子机制。     

乙型肝炎病毒adw亚型基因组在大肠杆菌中的克隆

从乙型adw亚型肝炎慢性患者的血浆中,分离纯化了乙型肝炎病毒(HBV)DNA,将HBVDNA以ECOR I酶切,与经ECOR I酶切、磷酸单脂酶处理的pBR325质粒DNA相连接,转化至大肠杆菌RR_1菌株。经筛选鉴定,转化子中有45株含有完整的HBV基因组DNA,应用限制内切酶分析,表明其位点与已报道的adw亚型有很大的不同。     

乙型肝炎病毒adr亚型X蛋白在大肠杆菌中的高效表达

将ａｄｒ亚型ＨＢＶ的完整Ｘ基因克隆到表达质粒ｐＰｒｏＥＸＨＴｂ中,实现了Ｘ蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达。表达产物全长１７９个氨基酸残基（其中Ｘ蛋白部分１５４个氨基酸残基）,分子量约１９．７ｋＤ,约占细菌总蛋白的３４％。其氨基端融合部分含有６组氨酸肽段,经ＨｉｓＴｒａｐＴＭ亲和层析纯化,一步可达纯度９３％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明,该表达产物可与ＨＢＶ感染患者体内的抗Ｘ抗体特异性结合。     

恒河猴脾肾细胞中的ANP样物质

用兔抗人α-心房利钠多肽(atrial natriure-tic peptide,ANP)血清和PAP免疫组织化学方法,观察到恒河猴脾白髓和肾髓质上皮细胞中存在ANP样免疫活性物质,其棕色颗粒,主要分布于细胞核周质内。猴脾提取物经Seph-adex G-15分离,可得到具有降压、利尿、利钠的组分,这些活性多肽的结构和功能需待进一步研究。     

非洲绿猴层黏连蛋白受体的克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达非洲绿猴层黏连蛋白受体(LR),对该受体蛋白进行纯化、复性研究。方法:采用RT-PCR从Vero-E6细胞总RNA中扩增非洲绿猴LR的cDNA序列,克隆到pGEM-TEasy载体上;将LR编码区插入到表达载体pET22b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG进行诱导表达;用镍亲和柱进行亲和纯化;采用分部透析方法进行复性。结果:非洲绿猴LR基因序列与人LR的基因编码序列有16个碱基差异,但蛋白序列只有1个氨基酸的改变。LR蛋白以包涵体形式表达。采用分部透析方法可使部分蛋白得到复性。结论:克隆了首个非洲绿猴的相对分子质量为37000的LR的基因,与人LR基因序列有16个碱基差异,但其中15处都为同义突变,所以二者的蛋白质序列只有1个氨基酸改变,即293位D→E,提示LR在进化中具有很大的保守性。     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及纯化抗原免疫原性的研究

本文报告了两个拷贝的adr亚型HBs基因的pSV2质粒组建,其中一个拷贝只含S基因,受SV40早期启动子的直接控制,另一个拷贝连接于pSV2质粒dhfr基因下游,含有前S和S基因及其本身的启动子,用此重组质粒转化CHO-dhfr~-细胞,经选择,获得了高效表达HBsAg的CHO-32-C23及CHO-Ⅱ-5细胞系,最佳培养条件及HBsAg分泌动态的研究结果表明,CHO-Ⅱ-5系细胞分泌HBsAg的最佳条件是37℃培养,培养基中加2％小牛血清,每日收换液;用5％小牛血清,每48小时收换液则次之,但较实用,转瓶培养产量约2.μg/ml,将CHO-32-C23细胞系产生的液体初步纯化,在聚丙烯酰胺凝胶上显示23k和27k蛋白带,用其免疫NIH小鼠,EDSO为0.119μg,对照血源菌ED_(50)为0.083μg,二者的免疫原性近似。     

氯仿对非洲绿猴肾细胞损伤机理的研究

目的　实验研究氯仿染毒 2 4h对非洲绿猴肾细胞的损伤及其机理。方法　运用显微荧光术测定了非洲绿猴肾细胞 (Vero细胞 )内活性氧 (ROS)含量及游离Ca2 + 浓度 ,同时 ,测定Vero细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力用于检查Vero细胞受损情况。结果　接触浓度为 4 0mmol L氯仿的Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 +浓度与对照组比较无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,同时 ,表示Vero细胞受损指标 (LDH活力 )也无显著性差异 (P >0 0 5 ) ;而接触浓度为 8 0mmol L、12 0mmol L氯仿的Vero细胞内ROS含量显著高于对照组 (P <0 0 1) ,其Vero细胞受损也显著增加 (P <0 0 5、P <0 0 1)。结论　较高浓度的氯仿能损伤Vero细胞 ,其损伤的可能途径是通过提高Vero细胞内ROS含量     

从乙型肝炎病毒表面抗原阳性母亲流产的胎儿查出乙型肝炎病毒标志

应用Southern blot杂交试验检测HBsAg及HBeAg均阳性母亲流产的9例胎儿肝细胞中HBV DNA的存在状态,并与其HBV血清学、免疫电镜及肝脏免疫组织化学的结果相比较。结果在3例胎肝高分子DNA中检出了整合的HBV DNA顺序,且此3例HBV DNA整合到胎肝细胞基因组并无特定部位,提示为随机整合。3例中2例的血清及肝匀浆都检出HBsAg颗粒,其胎肝细胞胞浆HBsAg也阳性;另1例受HBV感染的唯一标志是在胎肝细胞中存在着整合的HBVDNA。此外,另1例则仅胎肝细胞中HBsAg阳性而无整合的HBV DNA。在胎肝细胞中检出整合的HBV DNA进一步证实HBV子宫内传播途径的存在。     

表达乙型肝炎病毒表面抗原和Epstein-Barr病毒膜抗原的双价痘苗病毒的组建

从痘苗病毒天坛株分离了晚期11k蛋白编码基因的启动子,以痘苗病毒天坛株为载体,构建了双价的重组痘苗病毒。分别在7.5k和11k蛋白基因启动子的控制下,表达乙型肝炎病毒表面抗原和EB病毒的膜抗原。用重组痘苗病毒免疫的家兔,同时产生对这两种抗原的抗体。免疫电镜下观察到乙型肝炎病毒表面抗原颗粒。     

利用人摄金蛋白(METALLOTHIONEIN)启动子和牛乳突瘤病毒在哺乳动物细胞中表达乙型肝炎表面抗原

用人Metallothioenin-Ⅱ启动子、乙型肝炎表面抗原基因,SV40早期基因的编接位点和多聚A位点构成了表达组件,然后插入到经改造过的BpV-1质粒中。所得质粒pdMTsAg-5转染小鼠C127细胞得到转化克隆。Ausria Ⅱ检测证明13株中有12株能产生HBsAg。对其中一株进行HBsAg收率观察,隔天收获为292.6～525.8μg/升,每天收获为200.9～369.0μg/升,可连续收获60天以上。经重金属离子诱导后,收率增至583～854.4μg/升。培养液经超滤浓缩和两次密梯离心后,可集中为一个狭窄的峰,顶峰的Ausria Ⅱ cpm为1.05×10~7,密度为1.20g/ml。     

乙型肝炎病毒DNA在患者血清及肝组织中存在状态的研究

对29例肝炎,1例尸检肝组织和血清中乙型肝炎病毒的DNA(HBV DNA)进行了研究,发现HBsAg( )/HBeAg( )患者中,有9/17(52.94％)血清HBV DNA阳性;HBsAg( )/抗-HBe( )患者中,2/6(33.33％)也为阳性。从30例肝组织中提取DNA经琼脂糖电泳,Southern吸印转移及分子杂交试验结果表明,27例HBV DNA阳性,全部有游离型HBV DNA。27例中有5例经用标记pBR322探针杂交排除非特异杂交带后,在高分子量区有HBV DNA特异的杂交带,提示有HBV DNA整合。     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及其产物活性的初步检测

构建了pSV2DHWS2S质粒,使dhfr扩增基因及乙型肝炎病毒的Pre-S_2+S基因分别在两个SV40早期启动子的调控之下。此质粒转化到CHO-dhfr~-细胞,经克隆、加氨甲喋呤(MTX)筛选、扩增,建立了3个高效分泌HBsAg中蛋白及主蛋白的克隆细胞系。检测了其中的M6细胞系生物学特性。结果表明,免疫电镜下可观察到22nm的颗粒;该细胞用转瓶连续培养60天,每2天收、换液1次,每升HBsAg平均产量为2.9mg。经初步纯化,在SDS-PAGE中显示23k、27k主蛋白带及33k、36k中蛋白带。主蛋白及中蛋白的反相血凝(RPHA)滴度分别为64和128;中蛋白的ELISA滴度为320。部分品系小鼠免疫后能产生滴度为8的抗Pre-S_2抗体。3只家免中仅有1只在免疫后第1、2周可测出Pre-S_2抗体,而3只兔的S抗体滴度都较高,持续时间也较长。     

乙型肝炎病毒表面抗原多肽图谱与亚型关系

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western吸印法分析乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)多肽组成,与蛋白标准品比较获得分子量23000～50000 8种多肽,用单一抗各亚型因子血清分析,证实a抗原决定簇存在于多种多肽中,d抗原决定簇主要由分子量23000的多肽组成,而y抗原决定簇则由分子量31000及34000的两种多肽组成。     

哺乳动物细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原的理化和生物学性状

研究了哺乳动物细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)纯品的理化及生物学性状。结果表明:此种HBsAg在CsCl中的浮力密度是1.21g/cm~3;快速液相层析的SuperoseHR6层析柱上呈现3个峰,中间是一个主峰,两侧各一小峰;经Mono Q柱层析呈现一个对称峰,证明了HBsAg颗粒所带电荷的均一性;以SDS-PAGE和凝胶扫描方法分析HBsAg的多肽,P23、gp27和gp30各占65％、20％和10％,另有5％的二聚体存在;N-末端的氨基酸序列与转入细胞的目的基因所编码的序列相同;HBsAg在4℃和-20℃储存较稳定,室温条件保存时间不宜过长。动物实验证明:用与血源HBsAg疫苗同等剂量的基因工程HBsAg疫苗接种Balb/C小鼠,可获得比血源疫苗高2.64倍的免疫效果。此外,经过福尔马林处理的疫苗较未处理的疫苗有较强的免疫原性。