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rhGM—CSF/LIF融合蛋白基因的克隆及表达 总被引:2,自引:0,他引:2
利用基因重组技术,人工构建了一个编码五肽G-S-G-G-S的基因接头,将GM-CSF和LIF的cDNA相连而构成融合基因,将融合基因载入原核表达载体pBV220后转化大肠杆菌,经热诱导后进行Western印迹反应鉴定证实获得rhGM-CSF/LIF融合蛋白(简称rhgM-LIF)活性测定表明重组的融合蛋白具有两因子双重活性。 相似文献
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本文利用PCR技术和基因定位突变技术,将编码人肿瘤坏死因子α(hTNFα)和白细胞介素6(hIL-6)成熟肽的基因通过中间接头连接成编码单一蛋白的基因,构建了融合蛋白表达载体pBIT,并在大肠杆菌中得到了表达。SDS-PAGE的电泳胶薄层扫描显示,融合蛋白的表达量是菌体总蛋白量的20%,其分子量约为37kD。活性检测证实,融合蛋白既有TNF活性,又有IL-6活性。 相似文献
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人PSP94全长cDNA的获得及PSP94-TNF~Δ融合蛋白的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
利用RT-PCR从人肥大前列腺组织钓取94个氨基酸的人前列腺分泌蛋白(PSP94)全长cDNA,序列分析结果与文献报道的完全一致.将PSP94成熟肽与人TNFα衍生物(TNFΔ)通过Linker-SAPGTP在基因水平上融合成5′PSP94-TNFΔ,融合基因DNA序列分析结果与设计的相符合.5′PSP94-TNFΔ在大肠杆菌中表达产物分子量约为31kD,表达量约占菌体总蛋白量的35%.以L929细胞和人前列腺癌细胞株PC-3为靶细胞进行细胞毒分析结果表明,5′PSP94-TNFΔ融合蛋白既具有TNF的细胞毒活性,又具有对前列腺癌细胞PC-3的杀伤作用 相似文献
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乙肝病毒表面抗原preS1与人肿瘤坏死因子α融合基因的表达 总被引:6,自引:0,他引:6
用PCR法获得了HBsAgpreS1(1-65)肽段基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子(hTNFα)之后,插入表达载体PSB-92中,使融合基因的5′端直接置于大肠肝菌PL启动子下游,采用30℃培养,42℃诱导,获得了TNF与preS1(1-65)融合蛋白的表达产物。SDS-PAGE电泳显示表达产物为25kD,约占细菌总蛋白的35%。表达产物经Westernblot验证,能分别特异地与hTNFα抗体与preS1抗体结合,稀释复性后,该融合蛋白还具有TNF的生理功能(对L929细胞的细胞毒活性)。经DNA序列测定,preS1(1-65)肽基因正确地融合在hTNFα基因之后。该结果提供了一种制备preS1的新方法,为进一步开展治疗肝癌和乙肝的导向药物打下基础。 相似文献
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我们构建了新的硫氧还蛋白(Thioredoxin)融合表达载体pETTrxL和pETTrx-HisL,它们可使功能蛋白在大肠杆菌胞质中以可溶性形式高效表达。利用此表达系统成功地获得的hG-CSF-硫氧还蛋白融合蛋白的高效可溶性表达,表达水平达总细胞可溶蛋白的41%以上。所表达的hG-CSF-硫氧还蛋白融合蛋白可通过Cu2+-IDASepharoseFF固相金属螯合层析柱,方便地从细胞破碎可溶上清中直接纯化。所获得的融合蛋白具有hG-CSF特异的生物活性,其比活性达到0.5-1.33×107u/mg融合蛋白。这样表达的hG-CSF融合蛋白能被IgA蛋白酶特异地切割,将hG-CSF从融合蛋白上切下获得与天然蛋白一级结构完全一致的重组hG-CSF 。 相似文献
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基因工程表达产物的体外酰胺化加工 总被引:5,自引:0,他引:5
以C端为甘氨酸的修饰型人降钙素(mhCT-Gly)的融合蛋白为底物和利用重组酰胺化酶,研究建立基因工程表达产物的体外酰胺化加工系统。首先,人工合成mhCT-Gly基因,并构建其融合表达质粒pGEXCT,在大肠杆菌中获得了高效表达并通过新和层析分离纯化获得谷胱甘太S-转移酶(GST)融合蛋白(GST-mhCT-Gly)。同时,从稳定表达在鼠酰胺化酶的CHO细胞株中制备了重组酶腕化酶。然后,利用此重组 相似文献
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人表皮生长因子(EGF)与单核—巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)融合?… 总被引:1,自引:0,他引:1
应用基因工程技术,将EGF,GM-CSF基因克隆到pGEM-3Zf载体的EcoRI,BamHI位点上,再钭重组融合基因亚克隆到表达载体pBV220扔EcoRI,BamHI位点上,在大肠杆菌DH5α中进行表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot表明EG-FGM-CSF融全蛋白获得表达,并且具有EGF,GM-CSF免疫学活活。 相似文献
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高效融合表达中载体蛋白对hIGF—I免疫原性结构形成的… 总被引:3,自引:0,他引:3
利用人工全合成人胰岛素样生长因子I(hIGF-I)基因,构建了分别以β-半乳糖苷酶的三种即含590、310、280个氨基酸序列片段和一种以Protein A、C结构域为载体蛋白的融合型表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了以上各种hIGF-I的融合蛋白产物。通过对羟胺裂解前后的hIGF-I产物进行放射免疫结合测定分析;结果显示以β-Gal590、310、280为载体蛋白;均严重影响与其融合的hIGF- 相似文献
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重组人白细胞介素—6与肿瘤坏死因子突变体融合蛋白的构建及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
针对肿瘤坏死因子(TNF)在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上的白细胞介素-6(IL-6)受体明显增高的事实,根据TNF结构与功能研究的最新信息,利用PCR技术,对人TNFα基因进行了改造,并将共与IL-6成熟肽编码区cDNA通过人工接头进行融合,融合蛋白在大肠杆菌表达后,Westernblot分析表明,分子量约为37kD,活性检测结果证实,该融合蛋白兼具有TNF抗肿瘤活性和结合IL 相似文献
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利用PCR扩增得到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆pGEM-T构建成GM-CSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对72RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴 相似文献
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抗结肠癌相关抗原单链抗基因的构建和表达 总被引:3,自引:2,他引:1
通过PCR扩增和酶切分别得到抗结肠癌相关抗原抗体的重链可变区序列,轻链可变区序列及连接肽序列,将它们构建成为VH-linker-VL形式的单链抗体基因片段,并在大肠杆菌中进行了表达,SDS-PAGE分析结果表明,以pComb3为载体,在大肠杆菌JM83中,scFv未获得有效表达,而以pET-22b(+)为载体的scFv在大肠杆菌BL21(DE3)中,30℃诱导培养获得了高效表达,表达水平占全菌蛋白 相似文献
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缩短的人巨噬细胞集落刺激因子(M—CSF)在大肠杆菌中… 总被引:1,自引:1,他引:0
本文用聚合酶链反应(PCR)获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子cDNA基因,并克隆在质粒pAET3d中,在T7启动子指导下,在大肠杆菌BL2LysE中获得了和一个6组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合M-CSF表达量占菌体总蛋白的12%,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螯合新和层析一步纯化,所得的融合(His)6-M-CSF在还原型SDS-PAGE上基 相似文献
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人α-肿瘤坏死因子基因的高效表达 总被引:2,自引:0,他引:2
用人工合成的α-肿瘤坏死因子(TNF-α)基因构建了五个不同的表达质粒,它们不同之处是SD序列与起始密码子ATG间距离(D)各异。计算机模拟计算出翻译起始区域(TIR)中二级结构的最小生成自由能,以(D)为6个核苷酸时最小(绝对值)。它的表达效率也最高,产物TNF-α可达菌体总蛋白的60%。密码子的选用对表达效率有很大的影响,故人工合成TNF-α基因(选用大肠杆菌偏爱的密码子)的表达效率高于sc- 相似文献
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针对肿瘤坏死因子(TNF)在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上白细胞介素-6(IL-6)受体明显增高的事实,根据TNF结构与功能研究的最新信息,利用PCR技术,对人TNFα基因进行了改造,并将其与人IL-6成熟肽编码区cDNA通过人工接头进行融合。融合蛋白在大肠杆菌中表达后,Westernblot分析表明,分子量约为37kD;活性检测结果证实,该融合蛋白兼具有TNF抗肿瘤活性和结合IL-6受体的能力,在高表达IL-6受体的人骨髓瘤细胞上测得的细胞毒活性较同样位点突变的TNF高约3倍。 相似文献
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利用人工全合成人胰岛素样生长因子工(hIGF-I)基因,构建了分别以β-半乳糖苷醇(β-gal)的三种即含590、310、280个氨基酸序列片段和一种以ProteinA的B、C结构域(PABC)为载体蛋白的融合型表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了以上各种hIGF-I的融合蛋白产物。通过对羟胺裂解前后的hIGF-I产物进行放射免疫结合测定分析,结果显示以β-Gal690、310、280为载体蛋白,均严重影响与其融合的hIGF-I的免疫原性结构形成,但在PABC-hIGF-I融合蛋白中,载体蛋白PABC无明显的影响作用。这表明在高融合表达低分子量蛋白或肽段中,需选择适宜的载体蛋白,以利于目的产物的功能性结构形成。 相似文献
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GM-CSF高亲和力受体至少由两条链组成,低亲和力的α链及无结合力活性的β链。本文采用RT-PCR的方法,从GM-CSF依赖细胞株TF-1中克隆了全长的GM-CSFRα链Cdna(包括信号肽部分),经酶切及全基因测序鉴定,并分别在原核及真核细胞表达系统中表达。在大肠杆菌中GM-CSFRα以GST融合蛋白形式表达,谷胱甘肽Sepharose4B亲和层析纯化融合蛋白。GSTCSFRαC无受体活性,推测主要与缺乏翻译后修饰有关。将全基因克隆入真核表达载体Psvl中,转染COS-7细胞瞬时表达以重建GM-CSF的低亲和力受体,125IGM-CSF平衡结合实验证明转染后的COS-7细胞膜上有受体的表达,Crosslinking显示表达的受体α链分子量略低于TF-1细胞。胞外区基因(CSFRαB)克隆入Psvl构建的Psvl/CSFRαB表达载体,转染COS-7细胞后,Westernblot检测表达细胞上清,有单一的反应带,表达上清有GM-CSF的受体活性。 相似文献