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1.
应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒(CMV)启动子的基因片段和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的cDNA,克隆进逆转录病毒载体N2A,得到重组质粒N2A/CMV/hGM-CSF.经脂质体包装并转染包装细胞,通过G418药物筛选,得到抗性克隆。经PCR和Southemblot检测证实,GM-CSF基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达10 ̄4CFU/ml,克隆细胞培养上清用TF-1细胞可检测到GM-CSF活性。 相似文献
2.
用逆转录病毒载体表达人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子 总被引:1,自引:1,他引:1
应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒(CMV)启动子的基因片段和人粒细胞-茂噬细胞集落刺激因子(hGM-GSF)的cDNA,克隆进逆转录病毒载体N2A,得到重组质粒N2QA/CMV/hGM-CSF。经脂质体包装并转染包装细胞,通过G418药物筛选,得到抗生克隆。经PCR和Southern blot检测证实,GM-CSF基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达10^4CFU/ml,克 相似文献
3.
利用脑炎心肌炎病毒的内核糖体进入位点连接人TNF-αcDNA和选择基因NeoR基因,使TNF-α及NeoR基因均受控于病毒LTR启动子,将两基因同时转录至同一mRNA,从而构建成人TNF-α双顺反子逆转录病毒载体pGCEN/TNF-α.在LipofectAMINE介导下将其导入包装细胞PA317,G418筛选得单克隆,病毒滴度为106CFU/ml重组病毒分泌的细胞株.经PCR证明外源基因已整合至细胞基因组,Northern印迹显示出单一LRT转录本.持续G418筛选能明显促进目的基因TNF-α的表达.用重组病毒上清感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,G418筛选获得的混合抗性克隆持续高表达TNF-α,40Gyγ线照射后能维持高效表达至7d.实验结果表明,含IRES的双顺反子逆转录病毒载体将是一个很好的基因转移载体. 相似文献
4.
含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体的构建及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点,连接人TNF-α及IL-2cDNA和选择基因新霉素磷酸转移酶基因(NeoR),使TNF-α、IL-2及NeoR基因均受控于病毒LTR启动子,将这3个基因转录至同一mRNA,从而构建成含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体pGCEN/TRI。在LipofectAMINE介导下将其导入包装细胞PA317,G418筛选得单克隆,病毒滴度为5×105CFU/ml重组病毒分泌的细胞株,经PCR证明外源基因已整合至基因组,Northern印迹显示出单一转录本。用重组病毒上清感染不同的细胞,G418筛选所获得的抗性克隆能不同程度地表达TNF-α及IL-2。实验结果表明,含IRES的多顺反子逆转录病毒载体能很好地在同一靶细胞中表达多个外源基因。 相似文献
5.
细胞因子基因导入人肿瘤细胞的方法及鉴定 总被引:5,自引:0,他引:5
从人外周血单核细胞中抽提总RNA为模板,分别用5‘含EcoRⅠ3含BamHI限制性酶切位点的细胞因子基因特异引物成含信号肽全长IL-2,γ-IFN及α-TNFcDNA。然后将这些细胞因子cDNA分别重组入含筛选标记基因Neo逆转录病毒载体LXSN中,采用磷酸钙共沉淀法转染逆转录病毒包装细胞系PA317。分别收集到含IFN-γ,TNF-α和IL-2基因的缺陷型逆转录病毒上清及只具空白载体质粒pLXS 相似文献
6.
本文报道以人Epstein-Barr病毒的潜代膜蛋白基因BNLF-1作为目标基因,插入至逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)-LMP及其反义载体pZipNeoSV(x)-anti-LMP,通过质粒DNA的电转染和G418培养基筛选,然后对10个抗性克隆进行基因整合分析、获得6个含MLV-LTR/BVLF-1融合基因的阳性克隆,采用N 相似文献
7.
外源TGF—β1基因在小鼠ES细胞中的表达及其对细胞分化的影响 总被引:13,自引:1,他引:12
本文利用逆转录病毒载体Dol,在其BamHI酶切位点插入猪TGF-β1 1.7kbcKNA,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将该质粒DNA转染到小鼠ES-5细胞,经G418筛选获得抗G418的ES-5细胞克隆(ES-T),经RNA点杂交,Northern印迹杂交证明有6个细胞克隆能表达外源猪TGF-β1的mRNA,其中两个杂交信号较强的克隆进一步用Southern印迹杂交,也证明猪TGF-μ 相似文献
8.
逆转录病毒载体介导诱导型NO合酶在神经细胞中表达 总被引:4,自引:0,他引:4
为了深入研究诱导型一氧化氮合酶基因表达产物在阿片耐受和依赖中作用,采用脂质体介导基因转染技术,将iNOS cDNA重组逆转录病毒载体导入NG108-15神经细胞,获得G418抗性克隆,命名为NG-LNCXiNOS细胞。DNA印迹杂交,PCR扩增及RT-PCR和蛋白质免疫印迹杂交分析,证实NG-LNCXiNOS细胞有外源iNOS基因整合,转录和表达;NADPH黄递酶(NADPH diaphorase 相似文献
9.
以分离提取的HeLa细胞总RNA为模板,通过RT-PCR反应扩增得到了1017bp的人可溶性白细胞介素6受体(sIL-6R)cDNA片段,将扩增片段克隆到pUC19质粒中进行序列测定。结果证明该片的序列与文献报道的sIL-6RcDNA的序列完全一致,将sIL-6RcDNA与链霉素信号肽melCl的编码序列融合后得到的融合基因mel/sIL-6R克隆到链霉菌质粒pLJ459中,构建成重组表达质粒pL 相似文献
10.
逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因(mdr-1)导入小鼠造血细胞的实验研究 总被引:2,自引:0,他引:2
本文利用逆转录病毒介导的基因转移方法,将人多药耐药基因mdr-1导入小鼠造血细胞,并对转基因造血细胞的耐药性及移植特性进行了初步研究。含人mdr-1cDNA的重组逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导的基因转移方法导入包装细胞PA317,再经秋水仙素筛选。获得产逆转录病毒的包装细胞,其病毒滴度可达1.2×105cfu/ml。在含小鼠骨髓贴壁细胞层的长期培养体系中,利用逆转录病毒上清对造血细胞进行转染。通过抗性CFU-CM检测,其基因转移效率可达7.0%。将转基因造血细胞移植经照射预处理的小鼠,可重建受体小鼠造血功能。小鼠造血重建后4个月,其骨髓造血细胞与外周血细胞可检测到人mdr-1cDNA,且骨髓造血细胞对秋水仙素仍保留抗性 相似文献
11.
利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质灰病毒的内核糖体进行位点,连接人TNF-α及IL-2cDNA和选择基因新霉素磷酸转移酶基因(NeoR),使TNF-α、IL-2及NeoR基因均受控于病毒毒LTR启动子,将这3个基因转录至用一mRNA,从而构建成含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体pGCEN/TRI。在LipofectAMINE介导下将其导入包装细胞PA317,G418筛选得单克隆 相似文献
12.
本文报道以人Epstein-Barr病毒的潜伏膜蛋白基因BNLF-1作为目标基因,插入至逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)-LMP及其反义载体pZipNeoSV(x)-anti-LMP,通过质粒DNA的电转染和G418培养基筛选,然后对10个抗性克隆进行基因整合分析,获得6个含MLV-LTR/BNLF-1融合基因的阳性克隆,采用Northern杂交及Western印迹证明,在克隆细胞中表达了2.6kb的mRNA片段及相应的蛋白质分子,这是由BNLF-1基因的EDL1启动子表达的产物。 相似文献
13.
将bdnf基因克隆入逆转录病毒载体pLNCX,构建得到pLNC/BDNF,经PA317细胞包装后,感染大鼠成肌细胞L6TG,G418筛选2周后,得到稳定表达bdnf基因的细胞克隆L6TG/BDNF。DNA印迹结果证实bdnf基因已经整合入L6TG染色体中,RNA印迹和斑点印迹结果分别从mRNA水平和蛋白水平证明了bdnf基因的表达,且L6TG/BDNF培养上清中BDNF的含量约为25ng(106细胞数每ml每24h)。 相似文献
14.
利用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从人胎儿基底前脑中提取总RNA,用逆转录与聚合酶链反应相结合的RT-PCR法,扩增出人神经生长因子低亲和力受体p~(75)NGFR基因cDNA,在限制性内切酶SmaⅠ存在下的连接体系中,将扩增出的cDNA片段克隆入pUC12的SmaⅠ位或,经限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ酶切鉴定是否插入以及HindⅢ酶切鉴定方向。将重组质粒中的p~(75)NGFR的cDNA再次亚克隆至pUC12载体中后,以其双链DNA为模板,用末端终止法测出其全部核苷酸顺序,证实其核苷酸编码的p~(75)NGFR除两个碱基突变外,其余与文献完全一致。完整的p~(75)NGFR的cDNA分两步克隆到逆转录病毒表达载体pXT-1,经PA317包装细胞株体外包装后、收集病毒上清转染条件不死性大鼠小脑神经细胞系R2.初步结果表明转染了p~(75)NGFR的R2细胞株去除NGF培养时出现程序化死亡的典型特征梯型DNA带。 相似文献
15.
逆转录病毒介导CD基因在人结肠癌细胞中表达 总被引:2,自引:1,他引:1
构建了含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(EC-CD)的重组逆转录病毒载体LCDDSN。经PA317细胞包装后,感染人结肠癌细胞株LoVo。G418筛选得一的稳定表达EC-CD基因的细胞克隆LoVo/LCDSN。LoVo/LCDSN鹜型LoVo相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变。LoVo/LCDSN都对5-FU很敏感(IC50约为0.5μmol/L)。表达CD基因使细胞对基本无毒性的原药5-FC 相似文献
16.
以质粒pIJ486为载体,将来源于质粒pHT1的肿瘤坏死坏因子(TNF-a)cDNA克隆至变铅青链霉菌,以新霉素(30μg/ml)为选择标记,获得了数百转化子,实验表明No.7转化子s.lividans TK54-HT所含重组质粒pIJT7已克隆有TNFcDNA。L929细胞毒实验结果表明该转化子TNF表达量可达10^8活性单位/升以上,中和实验确证其表达产物为人TNF-a,SDS-PAGE表明克 相似文献
17.
以p53cDNA为探针,用Southern印迹法对人胃癌细胞系BGC823进行了检测,发现该细胞中p53基因存在异常,将可在真核细胞表达的重组野生型P53质粒pC53-SN3和突变型p53质粒pC53-SCX3,用指质体介导法,分别导入BCG823细胞,获得了较长时间受G418的多个阳性克隆。Southern抑迹法证实阳性克隆细胞中有外源性p53基因存在。 相似文献
18.
含人IL-2基因的真核表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
本工作用PCR由人的外周血单个核细胞。cDNA人中获取了带有信号肽的IL-2全cDNA克隆,并构建了不同的表达质粒:带有SV40启动子的以质粒为载体的pSVK3-IL2和以逆转录病毒为载体的pLN-IL2系列:pLNCIL2,pLNSIL2,pLIL2SN,它们分别带有CMV、SV40和LTR启动子。用DEAE-Dextran法、SA→脂质体法和电穿孔等方法分别将这些IL-2表达质粒转染人COS-7及CTLL-2细胞中,测定不同时间细胞培养液上清中IL-2的量。结果表明,这些表达质粒在靶细胞中均有不同程度的一过性表达,IL-2的分泌至少可持续5天,转染后72~96小时IL-2产量最高,一般可达28~30U/ml,最高为50U/ml。本工作比较了不同启动子和表达调控元件对IL-2表达的影响,还比较了在不同靶细胞中这些表达质粒产生IL-2的量。 相似文献
19.
水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的… 总被引:3,自引:0,他引:3
通过有机试剂抽提,CF-11纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株(RRSV-P)的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Segment 1到Segment 10(S1-S10)的10条双链RNA(dsRNA),然后设计合适的引物,用RT-PCR方法得到S9的cDNA并将其克隆到pUC119质粒上扩增,以双链测序法测定该cDNA的全序列。同时又将此cDNA克隆到大肠杆菌表达质粒pGEX 相似文献
20.
福尔马林固定云南鲴的DNA提取及其细胞色素b基因序列分析 总被引:12,自引:0,他引:12
福尔马林固定云南鲴的DNA提取及其细胞色素b基因序列分析DNAEXTRACTEDFROMFORMALIN-FIXEDXenocyprisyunnanensisANDSEQUENCEANALYSISOFITSCYTOCHROMEBGENE关键词福尔马林... 相似文献