用逆转录病毒载体表达人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子

应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的基因片段和人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）的ｃＤＮＡ,克隆进逆转录病毒载体Ｎ２Ａ,得到重组质粒Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ．经脂质体包装并转染包装细胞,通过Ｇ４１８药物筛选,得到抗性克隆。经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ检测证实,ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达１０￣４ＣＦＵ／ｍｌ,克隆细胞培养上清用ＴＦ－１细胞可检测到ＧＭ－ＣＳＦ活性。     

用逆转录病毒载体表达人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子

应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的基因片段和人粒细胞－茂噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＧＳＦ）的ｃＤＮＡ,克隆进逆转录病毒载体Ｎ２Ａ,得到重组质粒Ｎ２ＱＡ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ。经脂质体包装并转染包装细胞,通过Ｇ４１８药物筛选,得到抗生克隆。经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测证实,ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达１０＾４ＣＦＵ／ｍｌ,克     

人TNF-α双顺反子逆转录病毒载体的构建及其在成纤维细胞中的表达

利用脑炎心肌炎病毒的内核糖体进入位点连接人ＴＮＦ－αｃＤＮＡ和选择基因ＮｅｏＲ基因,使ＴＮＦ－α及ＮｅｏＲ基因均受控于病毒ＬＴＲ启动子,将两基因同时转录至同一ｍＲＮＡ,从而构建成人ＴＮＦ－α双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＴＮＦ－α．在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将其导入包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选得单克隆,病毒滴度为１０６ＣＦＵ／ｍｌ重组病毒分泌的细胞株．经ＰＣＲ证明外源基因已整合至细胞基因组,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹显示出单一ＬＲＴ转录本．持续Ｇ４１８筛选能明显促进目的基因ＴＮＦ－α的表达．用重组病毒上清感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３,Ｇ４１８筛选获得的混合抗性克隆持续高表达ＴＮＦ－α,４０Ｇｙγ线照射后能维持高效表达至７ｄ．实验结果表明,含ＩＲＥＳ的双顺反子逆转录病毒载体将是一个很好的基因转移载体．     

含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体的构建及表达

利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点,连接人ＴＮＦ－α及ＩＬ－２ｃＤＮＡ和选择基因新霉素磷酸转移酶基因（ＮｅｏＲ）,使ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及ＮｅｏＲ基因均受控于病毒ＬＴＲ启动子,将这３个基因转录至同一ｍＲＮＡ,从而构建成含人ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及ＮｅｏＲ基因多顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＴＲＩ。在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将其导入包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选得单克隆,病毒滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ重组病毒分泌的细胞株,经ＰＣＲ证明外源基因已整合至基因组,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹显示出单一转录本。用重组病毒上清感染不同的细胞,Ｇ４１８筛选所获得的抗性克隆能不同程度地表达ＴＮＦ－α及ＩＬ－２。实验结果表明,含ＩＲＥＳ的多顺反子逆转录病毒载体能很好地在同一靶细胞中表达多个外源基因。     

细胞因子基因导入人肿瘤细胞的方法及鉴定

从人外周血单核细胞中抽提总ＲＮＡ为模板,分别用５‘含ＥｃｏＲⅠ３含ＢａｍＨＩ限制性酶切位点的细胞因子基因特异引物成含信号肽全长ＩＬ－２,γ－ＩＦＮ及α－ＴＮＦｃＤＮＡ。然后将这些细胞因子ｃＤＮＡ分别重组入含筛选标记基因Ｎｅｏ逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中,采用磷酸钙共沉淀法转染逆转录病毒包装细胞系ＰＡ３１７。分别收集到含ＩＦＮ－γ,ＴＮＦ－α和ＩＬ－２基因的缺陷型逆转录病毒上清及只具空白载体质粒ｐＬＸＳ     

Epstein—Barr病毒BNLF—1基因的克隆及其在PA317细胞中？…

本文报道以人Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒的潜代膜蛋白基因ＢＮＬＦ－１作为目标基因,插入至逆转录病毒载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）－ＬＭＰ及其反义载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）－ａｎｔｉ－ＬＭＰ,通过质粒ＤＮＡ的电转染和Ｇ４１８培养基筛选,然后对１０个抗性克隆进行基因整合分析、获得６个含ＭＬＶ－ＬＴＲ／ＢＶＬＦ－１融合基因的阳性克隆,采用Ｎ     

外源TGF—β1基因在小鼠ES细胞中的表达及其对细胞分化的影响

本文利用逆转录病毒载体Ｄｏｌ,在其ＢａｍＨＩ酶切位点插入猪ＴＧＦ－β１ １．７ｋｂｃＫＮＡ,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将该质粒ＤＮＡ转染到小鼠ＥＳ－５细胞,经Ｇ４１８筛选获得抗Ｇ４１８的ＥＳ－５细胞克隆（ＥＳ－Ｔ）,经ＲＮＡ点杂交,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交证明有６个细胞克隆能表达外源猪ＴＧＦ－β１的ｍＲＮＡ,其中两个杂交信号较强的克隆进一步用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交,也证明猪ＴＧＦ－μ     

逆转录病毒载体介导诱导型NO合酶在神经细胞中表达

为了深入研究诱导型一氧化氮合酶基因表达产物在阿片耐受和依赖中作用,采用脂质体介导基因转染技术,将ｉＮＯＳ ｃＤＮＡ重组逆转录病毒载体导入ＮＧ１０８－１５神经细胞,获得Ｇ４１８抗性克隆,命名为ＮＧ－ＬＮＣＸｉＮＯＳ细胞。ＤＮＡ印迹杂交,ＰＣＲ扩增及ＲＴ－ＰＣＲ和蛋白质免疫印迹杂交分析,证实ＮＧ－ＬＮＣＸｉＮＯＳ细胞有外源ｉＮＯＳ基因整合,转录和表达;ＮＡＤＰＨ黄递酶（ＮＡＤＰＨ ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ     

可溶性白细胞介素6受体基因在链霉菌的克隆表达研究

以分离提取的ＨｅＬａ细胞总ＲＮＡ为模板,通过ＲＴ－ＰＣＲ反应扩增得到了１０１７ｂｐ的人可溶性白细胞介素６受体（ｓＩＬ－６Ｒ）ｃＤＮＡ片段,将扩增片段克隆到ｐＵＣ１９质粒中进行序列测定。结果证明该片的序列与文献报道的ｓＩＬ－６ＲｃＤＮＡ的序列完全一致,将ｓＩＬ－６ＲｃＤＮＡ与链霉素信号肽ｍｅｌＣｌ的编码序列融合后得到的融合基因ｍｅｌ／ｓＩＬ－６Ｒ克隆到链霉菌质粒ｐＬＪ４５９中,构建成重组表达质粒ｐＬ     

逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因(mdr-1)导入小鼠造血细胞的实验研究

本文利用逆转录病毒介导的基因转移方法,将人多药耐药基因ｍｄｒ－１导入小鼠造血细胞,并对转基因造血细胞的耐药性及移植特性进行了初步研究。含人ｍｄｒ－１ｃＤＮＡ的重组逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导的基因转移方法导入包装细胞ＰＡ３１７,再经秋水仙素筛选。获得产逆转录病毒的包装细胞,其病毒滴度可达１．２×１０５ｃｆｕ／ｍｌ。在含小鼠骨髓贴壁细胞层的长期培养体系中,利用逆转录病毒上清对造血细胞进行转染。通过抗性ＣＦＵ－ＣＭ检测,其基因转移效率可达７．０％。将转基因造血细胞移植经照射预处理的小鼠,可重建受体小鼠造血功能。小鼠造血重建后４个月,其骨髓造血细胞与外周血细胞可检测到人ｍｄｒ－１ｃＤＮＡ,且骨髓造血细胞对秋水仙素仍保留抗性     

含人TNF—α,IL—2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载？…

利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质灰病毒的内核糖体进行位点,连接人ＴＮＦ－α及ＩＬ－２ｃＤＮＡ和选择基因新霉素磷酸转移酶基因（ＮｅｏＲ）,使ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及ＮｅｏＲ基因均受控于病毒毒ＬＴＲ启动子,将这３个基因转录至用一ｍＲＮＡ,从而构建成含人ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及ＮｅｏＲ基因多顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＴＲＩ。在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将其导入包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选得单克隆     

Epstein-Barr病毒BNLF-1基因的克隆及其在PA317细胞中的表达

本文报道以人Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒的潜伏膜蛋白基因ＢＮＬＦ－１作为目标基因,插入至逆转录病毒载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）－ＬＭＰ及其反义载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）－ａｎｔｉ－ＬＭＰ,通过质粒ＤＮＡ的电转染和Ｇ４１８培养基筛选,然后对１０个抗性克隆进行基因整合分析,获得６个含ＭＬＶ－ＬＴＲ／ＢＮＬＦ－１融合基因的阳性克隆,采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明,在克隆细胞中表达了２．６ｋｂ的ｍＲＮＡ片段及相应的蛋白质分子,这是由ＢＮＬＦ－１基因的ＥＤＬ１启动子表达的产物。     

脑源性神经营养因子（BDNF）在成肌细胞中的稳定表达

将ｂｄｎｆ基因克隆入逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸ,构建得到ｐＬＮＣ／ＢＤＮＦ,经ＰＡ３１７细胞包装后,感染大鼠成肌细胞Ｌ６ＴＧ,Ｇ４１８筛选２周后,得到稳定表达ｂｄｎｆ基因的细胞克隆Ｌ６ＴＧ／ＢＤＮＦ。ＤＮＡ印迹结果证实ｂｄｎｆ基因已经整合入Ｌ６ＴＧ染色体中,ＲＮＡ印迹和斑点印迹结果分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白水平证明了ｂｄｎｆ基因的表达,且Ｌ６ＴＧ／ＢＤＮＦ培养上清中ＢＤＮＦ的含量约为２５ｎｇ（１０６细胞数每ｍｌ每２４ｈ）。     

人神经生长因子低亲和力受体（p~（75）NGFR）cDNA的克隆及其在神经细胞中表达活性的初步研究

利用酸性异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法从人胎儿基底前脑中提取总ＲＮＡ,用逆转录与聚合酶链反应相结合的ＲＴ－ＰＣＲ法,扩增出人神经生长因子低亲和力受体ｐ~（７５）ＮＧＦＲ基因ｃＤＮＡ,在限制性内切酶ＳｍａⅠ存在下的连接体系中,将扩增出的ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＵＣ１２的ＳｍａⅠ位或,经限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＰｓｔⅠ酶切鉴定是否插入以及ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定方向。将重组质粒中的ｐ~（７５）ＮＧＦＲ的ｃＤＮＡ再次亚克隆至ｐＵＣ１２载体中后,以其双链ＤＮＡ为模板,用末端终止法测出其全部核苷酸顺序,证实其核苷酸编码的ｐ~（７５）ＮＧＦＲ除两个碱基突变外,其余与文献完全一致。完整的ｐ~（７５）ＮＧＦＲ的ｃＤＮＡ分两步克隆到逆转录病毒表达载体ｐＸＴ－１,经ＰＡ３１７包装细胞株体外包装后、收集病毒上清转染条件不死性大鼠小脑神经细胞系Ｒ２．初步结果表明转染了ｐ~（７５）ＮＧＦＲ的Ｒ２细胞株去除ＮＧＦ培养时出现程序化死亡的典型特征梯型ＤＮＡ带。     

逆转录病毒介导CD基因在人结肠癌细胞中表达

构建了含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因（ＥＣ－ＣＤ）的重组逆转录病毒载体ＬＣＤＤＳＮ。经ＰＡ３１７细胞包装后,感染人结肠癌细胞株ＬｏＶｏ。Ｇ４１８筛选得一的稳定表达ＥＣ－ＣＤ基因的细胞克隆ＬｏＶｏ／ＬＣＤＳＮ。ＬｏＶｏ／ＬＣＤＳＮ鹜型ＬｏＶｏ相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变。ＬｏＶｏ／ＬＣＤＳＮ都对５－ＦＵ很敏感（ＩＣ５０约为０．５μｍｏｌ／Ｌ）。表达ＣＤ基因使细胞对基本无毒性的原药５－ＦＣ     

人肿瘤坏死因子基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

以质粒ｐＩＪ４８６为载体,将来源于质粒ｐＨＴ１的肿瘤坏死坏因子（ＴＮＦ－ａ）ｃＤＮＡ克隆至变铅青链霉菌,以新霉素（３０μｇ／ｍｌ）为选择标记,获得了数百转化子,实验表明Ｎｏ．７转化子ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ５４－ＨＴ所含重组质粒ｐＩＪＴ７已克隆有ＴＮＦｃＤＮＡ。Ｌ９２９细胞毒实验结果表明该转化子ＴＮＦ表达量可达１０＾８活性单位／升以上,中和实验确证其表达产物为人ＴＮＦ－ａ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明克     

p53基因对人胃癌细胞系恶性生长的影响

以ｐ５３ｃＤＮＡ为探针,用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法对人胃癌细胞系ＢＧＣ８２３进行了检测,发现该细胞中ｐ５３基因存在异常,将可在真核细胞表达的重组野生型Ｐ５３质粒ｐＣ５３－ＳＮ３和突变型ｐ５３质粒ｐＣ５３－ＳＣＸ３,用指质体介导法,分别导入ＢＣＧ８２３细胞,获得了较长时间受Ｇ４１８的多个阳性克隆。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ抑迹法证实阳性克隆细胞中有外源性ｐ５３基因存在。     

含人IL－2基因的真核表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达

本工作用ＰＣＲ由人的外周血单个核细胞。ｃＤＮＡ人中获取了带有信号肽的ＩＬ－２全ｃＤＮＡ克隆,并构建了不同的表达质粒：带有ＳＶ４０启动子的以质粒为载体的ｐＳＶＫ３－ＩＬ２和以逆转录病毒为载体的ｐＬＮ－ＩＬ２系列：ｐＬＮＣＩＬ２,ｐＬＮＳＩＬ２,ｐＬＩＬ２ＳＮ,它们分别带有ＣＭＶ、ＳＶ４０和ＬＴＲ启动子。用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法、ＳＡ→脂质体法和电穿孔等方法分别将这些ＩＬ－２表达质粒转染人ＣＯＳ－７及ＣＴＬＬ－２细胞中,测定不同时间细胞培养液上清中ＩＬ－２的量。结果表明,这些表达质粒在靶细胞中均有不同程度的一过性表达,ＩＬ－２的分泌至少可持续５天,转染后７２～９６小时ＩＬ－２产量最高,一般可达２８～３０Ｕ／ｍｌ,最高为５０Ｕ／ｍｌ。本工作比较了不同启动子和表达调控元件对ＩＬ－２表达的影响,还比较了在不同靶细胞中这些表达质粒产生ＩＬ－２的量。     

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的…

通过有机试剂抽提,ＣＦ－１１纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ １到Ｓｅｇｍｅｎｔ １０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）,然后设计合适的引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增,以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ     

福尔马林固定云南鲴的DNA提取及其细胞色素b基因序列分析

福尔马林固定云南鲴的ＤＮＡ提取及其细胞色素ｂ基因序列分析ＤＮＡＥＸＴＲＡＣＴＥＤＦＲＯＭＦＯＲＭＡＬＩＮ－ＦＩＸＥＤＸｅｎｏｃｙｐｒｉｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓＡＮＤＳＥＱＵＥＮＣＥＡＮＡＬＹＳＩＳＯＦＩＴＳＣＹＴＯＣＨＲＯＭＥＢＧＥＮＥ关键词福尔马林...