人粒细胞集落激因子cDNA的克隆,序列鉴定及初步表达

利用多聚酶链反应技术,从人膀胱癌细胞系５６３７细胞中快速扩增并克隆了人粒细胞集落刺激因子ｃＤＮＡ,序列分析证明,该ｃＤＮＡ包含人粒细胞集落刺激因子的全部编码基因,全长６１２ｂｐ,编码３０个氨基酸的信号肽和１７４个氨基酸的成熟蛋白。其中第４３位ｃｏｄｏｎ出现一个碱基的突变（ＣＡＣ→ＴＡＣ）导至第４３位氨基酸的改变（组氨酸→酪氨酸）。经逆转录病毒导入ＳＰ２／０细胞并初步表达。结果表明：该基因产物具有Ｇ     

聚乙二醇定点修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体的研究

研究了重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的聚乙二醇化修饰、分离纯化和活性鉴定。通过对人重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)第1,3,4,5,17位氨基酸进行突变,并在C末端加了一个半胱氨酸,获得了体外活性为原型rhG-CSF150%以上的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)。然后用分子量为20kD的甲氧聚乙二醇马来酸酐(mPEG-Mal)修饰rmhG-CSF,反应混合物经离子交换和凝胶过滤柱纯化,得到纯化的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)。SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的PEG-rmhG-CSF的纯度大于95%,体外活性分析表明PEG-rmhG-CSF活性优于目前临床使用的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF,NeulastaR○),药代动力学研究表明PEG-rmhG-CSF体内半衰期约为14h,比修饰前延长了7倍。     

聚乙二醇定点修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体的研究

研究了重组人粒细胞集落刺激因子突变体（rmhG-CSF）的聚乙二醇化修饰、分离纯化和活性鉴定。通过对人重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）第1,3,4,5,17位氨基酸进行突变,并在C末端加了一个半胱氨酸,获得了体外活性为原型rhG-CSF 150％以上的重组人粒细胞集落刺激因子突变体（rmhG-CSF）。然后用分子量为20kD的甲氧聚乙二醇马来酸酐（mPEG-Mal）修饰rmhG-CSF,反应混合物经离子交换和凝胶过滤柱纯化,得到纯化的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子突变体（PEG-rmhG-CSF）。SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的PEG-rmhG-CSF的纯度大于95％,体外活性分析表明PEG-rmhG-CSF活性优于目前临床使用的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子（PEG-rhG-CSF,Neulasta^?）,药代动力学研究表明PEG-rmhG-CSF体内半衰期约为14h,比修饰前延长了7倍。     

鸡磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的差异表达与低氧适应性

通过测序检测了藏鸡、白莱航鸡和寿光鸡调节细胞葡萄糖代谢的糖酵解酶磷酸甘油酸激酶(PGK)编码基因的基因组序列, 发现了4个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)为藏鸡与其他两个品种之间的差异. 实验表明其中1个SNP即外显子10上第59位A→G突变(第379位氨基酸由M变为T)后具有低氧诱导因子(HIF-1)结合位点, 即含有低氧应答元件(HRE). 机体受低氧刺激时HRE与HIF-1的结合活性会相应增加. 低氧孵化可导致胚胎死亡率升高, 且发育正常胚胎A→G的突变率非常高, 具有低氧适应性. 研究指出, PGK基因的M→T突变是低氧适应有利突变, 在低氧刺激下, 低氧诱导因子-1将上调骨骼肌组织糖酵解酶PGK基因的表达, 利用糖酵解途径为机体提供能量, 满足机体活动需要, 进而适应外界环境.     

海胆Runx基因保守序列的克隆与初步分析

Runx(Runt box)是Runt结构域转录因子家族的成员之一。马粪海胆Runx基因第663位和728位碱基发生突变,分别为A→T和C→T。第一个突变为错义突变,使密码子编码的氨基酸由天冬氨酸变为酪氨酸,而第二个突变为同义突变,密码子编码的氨基酸未发生变化。海胆Runx基因保守序列的突变可能会导致其表达产物的变化,进而会影响海胆的生理机能。     

乙脑病毒持续感染株preM区序列分析

为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒。利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较。preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸)。对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同。认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关。     

聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的药效学研究

比较研究聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)与重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)升高环磷酰胺所致外周血白细胞降低的Blab/c小鼠的白细胞效果.结果显示一次注射聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子与多次注射重组人粒细胞集落刺激因子的药效作用相当,且各剂量间呈良好的量效关系.     

乙脑病毒持续感染株preM区序列分析

为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒.利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较.preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸).对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同.认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关.     

巴西橡胶树43 kD橡胶粒子膜蛋白基因的cDNA克隆及表达

对43 kD的橡胶粒子膜蛋白进行了分离纯化和其N端氨基酸序列分析,根据N端氨基酸序列,设计一简并引物,通过3'RACE(Rapid Amplification ofcDNA Ends)的方法,获得了43 kD的橡胶粒子膜蛋白的cDNA.该cDNA含有1 385个核苷酸,含有完整的阅读框架,编码381个氨基酸.在终止密码子下游,包含有一个239bp的3'非编码区.该cDNA由5个首尾相连的重复单元组成,每个单元编码76个氨基酸组成的泛素(ubiquitin)单体.编码43 kD橡胶粒子蛋白的基因具有多个拷贝,在胶乳、叶片和树皮都表达.     

人血清白蛋白和粒细胞集落刺激因子融合蛋白的克隆表达

构建重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子（HSA-hG-CSF）表达载体,用毕赤酵母表达该重组蛋白。PCR扩增出人血清白蛋白基因（HSA）和粒细胞集落刺激因子基因（hG-CSF）,GGGGS作为小肽接头,采用重叠PCR的方法将HSA和hG-CSF拼接起来,与质粒载体pPIC9K连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α。抽提质粒,用SalI酶切重组质粒,电转化法导入毕赤酵母SMD1168中,通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌。Western-blotting分析表明融合蛋白具有粒细胞集落刺激因子免疫原性。NFS-60细胞测活实验分析表明体外活性达到约4.0×10^7IU/mg。     

Molecular cloning and expression of the cDNA encoding feline granulocyte colony-stimulating factor.

Both genomic DNA and cDNA of the feline granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) gene were cloned from CRFK cells. Southern blot analysis showed that the haploid genome contains a single copy of the G-CSF gene. The RT-PCR analysis of several feline cell lines revealed expression of G-CSF mRNA in response to lipopolysaccharide stimulation. Sequence analysis of genomic and cDNA clones indicated that the intron-exon junction structure is conserved between the human and the feline G-CSF genes. The G-CSF coding region encodes a predicted protein of 195 amino acids including a signal sequence of 21 amino acids. The feline G-CSF amino acid sequence shares a high degree of identity with the canine (90.8%), human (87.4%), ovine (83.9%), bovine (82.8%), porcine (80.5%), murine (70.7%) and rat (66.8%) G-CSF. The feline G-CSF expressed in insect cells using recombinant baculovirus vector was biologically active as measured in a proliferation assay using NFS-60 cells and an induction assay of leukocytes in cats.     

The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor.

Two different cDNAs for human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) were isolated from a cDNA library constructed with mRNA prepared from human squamous carcinoma cells, which produce G-CSF constitutively. The nucleotide sequence analysis of both cDNAs indicated that two polypeptides coded by these cDNAs are different at one position where three amino acids are deleted/inserted. When the two cDNAs were introduced into monkey COS cells under the SV40 early promoter, both of them produced proteins having authentic G-CSF activity and some difference in the specific activity was suggested. A human gene library was then screened with the G-CSF cDNA and the DNA fragment containing the G-CSF chromosomal gene was characterized by the nucleotide sequence analysis. The human G-CSF gene is interrupted by four introns and a comparison of the structures of the two G-CSF cDNAs with that of the chromosomal gene indicated that the two mRNAs are generated by alternative use of two 5' splice donor sequences in the second intron of the G-CSF gene. When the G-CSF chromosomal gene was expressed in monkey COS cells by using the SV40 enhancer two mRNAs were detected by S1 mapping analysis.     

人巨噬细胞集落刺激因子（hM－CSF）基因的合成及表达

按照ｈＭ－ＣＳＦ基因的序列,适当采用大肠杆菌的优选密码子,人工合成了Ｍ－ＣＳＦ的基因。在合成中我们采用了分段克隆和顺次克隆的方法,在次级克隆中我们成功地使用了多片段分组连接和多片段一次克隆战略,还尝试了多种单链战术。在表达载体的构建中,充分利用人工合成基因的灵活性,通过对Ｎ端６个氨基酸编码的变换及ＳＤ序列－ＡＴＧ间距离的改变,获得了在大肠杆菌中高效表达的重组体,表达的蛋白量占菌体总蛋白的２９％。目的蛋白在表达中形成的包含体形式,简化了产物的纯化。     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF164)基因并分析其基本表达模式。采用RT-PCR技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用半定量RT-PCR方法进行组织表达检测。获得了内蒙古白绒山羊VEGF164基因编码区cDNA全长序列,扩增片段全长573 bp,包含了完整的ORF,编码190个氨基酸残基。核苷酸序列与绵羊的VEGF164(EU857623.1)基因同源性为99%,相应的氨基酸序列同源性为99%。SMART程序分析表明,ORF编码的蛋白质具有信号肽序列及血小板衍生和血管内皮生长因子家族(PDGF,VEGF)结构域。Psite程序分析表明,有1个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶磷酸化位点。ProtComp Version 9.0程序分析将其定位于细胞外。RT-PCR检测表明,VEGF164基因在绒山羊脑、心脏、睾丸、胰腺、脾、肾和肺组织中均有表达。     

人白细胞介素-17基因的克隆、表达及其表达产物的分离纯化

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地从ＰＩ（ＰＭＡ,Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）、ＰＨＡ活化的人Ｔ细胞中扩增出ｈＩＬ－１７编码区ｃＤＮＡ（４６８ｂｐ）,克隆测序证实得到该基因．用特殊设计的引物扩增ｈＩＬ－１７成熟肽编码区（４１４ｂｐ）,接入表达载体ｐＥＴ３０ａ质粒中．ｐＥＴ３０ａ－ｍｈＩＬ－１７在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得高效表达,目的蛋白占总菌体蛋白５０％左右．经凝胶过滤和阴离子交换层析两步分离纯化和复性,得到单体型ｒｍｈＩＬ－１７,纯度达９８％以上,Ｎ端１６个氨基酸序列分析,结果与文献报道一致．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法测定分子量为１６ｋＤ,薄层丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析该蛋白等电点为ｐＨ８．８～８．９,３ＨＴｄＲ参入法测定ｒｍｈＩＬ－１７单体的体外活性,实验结果表明ｒｍｈＩＬ－１７对ＰＨＡ活化人的ＰＢＭＣ细胞具有抑制作用,结果同可溶型ＩＬ－１７Ｒ性质相似     

杀菌通透性增加蛋白基因的克隆及在CHO细胞中的表达

从一名健康中国人外周血白细胞中克隆出杀菌 通透性增加蛋白 (BPI)基因 ,全长1 45 2bp,编码 2 7个氨基酸的信号肽和 45 6个氨基酸成熟蛋白。序列比较发现 ,此序列与国外发表的序列有 6个核苷酸的差异 ,编码蛋白有 4个氨基酸的差异。构建真核表达质粒 ,在CHO细胞中实现BPI基因的稳定表达。对重组蛋白初步纯化后进行杀菌实验 ,结果表明重组蛋白具有与天然蛋白同样的生物活性。     

人骨髓基质细胞中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶DcDNA的克隆

为探讨人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)cDNA的结构及功能 ,应用RT PCR从人骨髓基质细胞中克隆了长约 2 6kb的GPI PLDcDNA ,包含完整阅读框架 ,编码 2 3个氨基酸的信号肽及 817个氨基酸的成熟肽 .该cDNA与人胰腺GPI PLDcDNA几乎百分之百同源 ,与人肝脏GPI PLDcDNA同源性为 95 %,氨基酸同源性为 94 %,3者对应的结构基因只有 1个 ,位于人类第 6号染色体上 ,基因组序列长约 80kb ,包括 2 5个外显子 .构建克隆的GPI PLDcDNA的真核表达载体 ,通过脂质体转染能表达GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶 (PLAP)而无GPI PLD活性的G9细胞 ,同时设立对照组检测GPI PLDcDNA的功能 .结果显示 ,对照组细胞几乎检测不到GPI PLD活性 ,其表达的PLAP主要位于细胞膜上 ;而转染GPI PLDcDNA的G9细胞能检测到较高水平的GPI PLD活性 ,而且大部分酶活性存在于培养液中 ,其表达的PLAP也主要被释放入培养液 .结果证实 ,从人骨髓基质细胞中克隆的GPI PLDcDNA有生物学功能 ,它能释放细胞膜上GPI锚定蛋白质 .     

棉蚜2个乙酰胆碱酯酶cDNA片段的基因克隆与序列分析

采用RT－PCR技术,利用简并引物从棉蚜（Aphis gossypii Glover)中克隆出2个乙酰胆碱酯酶基因的cDNA片段,Ag,ace 1l和Ag.ace2.Ag.ace1基因的cDNA片段为282bp,编码94个氨基酸;Ag.ace2基因的cDNA片段为264bp,编码88个氨基酸。扩增获得的2个乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段所编码的氨基酸序列均与其他昆虫的乙酰胆碱酯酶基因有很高的同源性。首次从一种昆虫中克隆出2个乙酰胆碱酯酶基因片段,为同一种昆虫中存在多个乙酰胆碱酯酶基因的假设提供了直接的分子生物学证据。     

Cloning and functional expression of a human heparanase gene.

We have cloned a gene (HSE1) from a human placental cDNA library that encodes a novel protein exhibiting heparanase activity. The cDNA was identified through peptide sequences derived from purified heparanase isolated from human SK-HEP-1 hepatoma cells. HSE1 contains an open reading frame encoding a predicted polypeptide of 543 amino acids and possesses a putative signal sequence at its amino terminus. Northern blot analysis suggested strong expression of HSE1 in placenta and spleen. Transient transfection of HSE1 in COS7 cells resulted in the expression of a protein with an apparent molecular mass of 67-72 kDa. HSE1 protein was detectable in conditioned media but was also associated with the membrane fraction following cell lysis. The HSE1 gene product was shown to exhibit heparanase activity by specifically cleaving a labeled heparan sulfate substrate in a similar manner as purified native protein.