siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Smallinterfering RNA,siRNA)载体的前体.依据文献提供的扩增H1 RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1 RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增H1RNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1.另外将H1 RNA启动子插入pGEM-11fz相应位点,构建瞬时表达载体pGH1.依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体.将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP-N3共转染Bel-7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应.研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究.     

KLF4siRNA慢病毒载体构建和鉴定

目的:构建上皮锌指蛋白4(Krüppel-like factor 4,KLF4)siRNA慢病毒载体并进行初步鉴定,为研究KLF4在宫颈细胞癌中的分子机制奠定基础。方法:利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则,设计4个RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的单链DNA oligo,然后退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证,测序结果经比对确认正确的克隆,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。收集上清液感染宫颈癌He La细胞,通过q RT-PCR及Western Blot鉴定KLF4 siRNA慢病毒干扰效果。结果:成功构建KLF4 siRNA慢病毒载体。KLF4 siRNA慢病毒感染He La细胞后,q RT-PCR及Western Blot测定结果显示,KLF4表达明显降低。结论:KLF4 siRNA慢病毒载体构建及包装成功,可有效抑制KLF4表达,为研究KLF4生物学功能奠定基础。     

甲病毒表达载体系统的研究进展

甲病毒载体是一种新型的载体系统，近年来，关于该载体系统的研究很我，尤其是在蛋白质的表达、结构与功能的研究以及疫苗的研制方面，本文仅就甲病毒载体的构建及其应用作一简单介绍。     

中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖基因的生理和病理意义,利用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总ＲＮＡ中扩增出肥胖基因编码区序列（ＣＤＮＡ）,定向亚克隆至ＰＵＣ１９质粒,克隆的ＯＢＣＤＮＡ不含信号肽序列并加入了亲折起始密友子ＡＴＧ〈序列分析表明,与日本报道的人ＯＢＣＤＮＡ相比,多出一个谷氨酸密码子ＣＡＧ,将ＯＢＣＤＮＡ定向克隆至原功体ＰＢＶ２２０,构建了重组ＯＢ基因表达质粒ＰＢＶ     

绿色荧光蛋白基因TuMv病毒表达载体的构建

本研究通过设计引物进行PCR扩增得到绿色荧光蛋白GFP基因,将PCR产物酶切以后与芜菁花叶病毒表达载体相连,得到的阳性克隆通过多对引物组合进行PCR验证及序列测定,说明GFP基因已经连接到该病毒表达载体中,而且没有发生碱基误配及错配。该GFP表达载体的构建为进一步利用TuMv的全长cDNA侵染性克隆进行外源基因的转化奠定了基础。     

犬瘟热病毒H基因原核表达载体的构建

利用本实验以前构建的含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-T质粒,根据pMD18-T-H序列设计带有XbalI和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因进行PCR扩增,得到约1800bp左右的片段。该片段被克隆到pMD18-Tsimple载体上,用XbalI和HindⅢ进行单、双酶切鉴定．筛选阳性克隆。将阳性克隆再用XbalI和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDVH基因片段。将原核表达载体pPROEXTMHTa、pet-30b用同样的方法酶切,回收载体片段。将CDVH基因片段分别用T4连接酶连接到回收的pPROEXTMHTa、pet-30b载体上,构建原核表达载体质粒pPROEXTMHTa-H和pet-30b-H。再用XbalI和HindⅢ进行单、双酶切鉴定阳性载体。本实验为下一步H蛋白表达、纯化并作为CDV诊断用抗原及CD的免疫预防奠定了基础。     

介导siRNA传递的非病毒载体及其研究进展

RNA干扰(RNAi)是一种疾病治疗的新途径,其中小干扰RNA(siRNA)可破坏mRNA的完整性,抑制疾病相关基因的表达,而开发安全有效的siRNA传递载体仍面临巨大挑战。相较于病毒载体系统,非病毒载体系统安全性高、负载量大、生物相容性好,更适用于疾病治疗。综述了可用于siRNA传递的一些非病毒载体(包括脂质体、细胞穿膜肽、水凝胶、树枝状大分子、磷酸钙、碳纳米管等),阐述了载体与siRNA的结合,靶向疾病组织或细胞并诱导特异基因沉默的机制、瓶颈问题等。     

XJ—160病毒复制子型表达载体的构建

D-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxjl60。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。     

pGEX-L系列表达载体的构建

对ｐＧＥＸ系列表达载体的多克隆位点（ＭＣＳ）进行了改造,改造前ＭＣＳ上仅有ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ和ＥｃｏＲＩ三个酶切位点。改造后的ＭＣＳ上含有８个酶切位点,它们分别是ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＡｖａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌⅡ、ｐｓｔⅠ、ＫｐｎＩ和ＥｃｏＲＩ,改造后构建形成的ｐＧＥＸ－Ｌ系列载体对目的基因的插入有更强的适应性。     

综述: siRNA脂质纳米输送载体的研究进展

siRNA能高效且特异地阻断内源性同源基因的表达即RNA干涉(RNAi)．RNAi在临床中的应用需要开发安全有效的输送系统,脂质纳米输送载体是一种具有发展潜力的siRNA输送系统．siRNA-脂质复合物的形成主要通过静电相互作用,静电作用必须足够强以至于载体在运输过程中不释放siRNA,而载体到达治疗部位时,解聚释放出siRNA．载体的粒径应小于100 nm,以利于细胞的摄取和透过特定部位的血管开窗．为了减少网状内皮系统(RES)的摄取和延长载体的循环时间,载体的表面由聚乙二醇修饰．本文主要综述了构建siRNA输送载体的基本要求．     

GFP与微管结合蛋白和肌动蛋白结合区融合蛋白载体构建与表达

以pCAMBIA1 30 0、pBA0 0 5、pActl D和pMECA等 4个质粒载体为基础 ,根据不同需要 ,选择特定的限制性内切酶作完全或部分酶切 ,通过多步骤的酶切、连接、转化等过程 ,构建完成 2个可通过农杆菌介导转化的植物表达载体。分别命名为 :pActl GFPTALIN和pActl GFP2 MAP4BD。在洋葱表皮细胞中的瞬间表达结果显示 ,两个载体均可正常工作。     

P27特异性siRNA重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建针对P27的siRNA腺病毒载体及相应的对照病毒载体,并鉴定重组腺病毒在小鼠胰岛中对内源性皿7基因表达的影响。方法合成针对p27的siRNA的靶DNA序列及相应的阴性对照序列,连接至pShuttle-H1质粒中,然后用NotI和HindHI限制性内切酶将H1-siRNA片段从pShuttle—H1-siRNA质粒上双酶切下来,克隆至空载pAdTrack穿梭质粒上,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染QBI-293A细胞,包装得到pAd—P27-siRNA和pAd—NC重组腺病毒。用病毒体外感染小鼠胰岛,Western印迹法检测P27蛋白表达水平。结果重组腺病毒载体经测序鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能有效抑制小鼠胰岛中P27的表达。结论成功构建了针对P27的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究P27在胰岛β细胞生长中的作用提供了基础。     

鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因(ov)的5′和3′调控区,将其克隆入pGEMT载体,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体5′调控区的下游,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡,RTPCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中,仅输卵管膨大部能检测出β半乳糖苷酶活性(1167mUml),注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用(1533mUml),重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中(1733mUml)。结果表明,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

促红细胞生成素基因表达载体的构建及其在CHO细胞中表达的研究

用从基因文库中所克隆的促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因,构建了３种由不同启动子调控的表达载体——ｐＯＰ１３／ＥＰＯ,ｐＲＳＶ／ＥＰＯ,ｐＣＭＶ／ＥＰＯ,在这３个表达载体的构建过程中对基因的转录起始效率、内含子的剪接、５′非翻译区和３′非翻译区对基因表达的影响等因素都加以考虑．用脂质体转染法分别将上述３个载体导入ＣＨＯ细胞,经瞬时表达,用ＥＬＩＳＡ方法检测,表达量分别为１９０ｍＩＵ／ｍｌ、１６０ｍＩＵ／ｍｌ、４４７ｍＩＵ／ｍｌ．用表达载体ｐＯＰ１３／ＥＰＯ转染ＣＨＯ－Ｋ１２细胞,在４００μｇ／ｍｌ的Ｇ４１８浓度下筛选稳定表达细胞克隆,获得了表达量约为１６０ＩＵ／１０６细胞（４８ｈ）的Ｃ１０细胞株．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测发现了ＥＰＯ阳性条带．用ＴＦ－１细胞对ＥＰＯ进行了生物活性检测,初步证实所表达的ＥＰＯ有生物活性．     

通用真核质粒表达载体的构建

利用真核基因表达调控的原理,以pSV2-dhfr为起始材料,构建了两个通用的真核质粒表达载体pMAML1-dhfr和pMAML2-dhfr,它们包含人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子调控元件,由两个转录方向相同或相反的表达单元组成.以荧火虫荧光素酶基因为报道基因,β-半乳苷酶基因为内对照,借助COS-7短暂表达系统,研究了它们对荧光素酶表达的影响,并比较了它们与出发载体pSV2-dhfr的相对强弱.     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率。方法合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSileneer载体．构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体。将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT—PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平。结果酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT—PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43．6％、47．7％和81．6％,它们的干扰效果被Western印迹所证实。结论干扰率为81．6％的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,。岜可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究。     

哺乳动物细胞小干扰RNA库的建立和应用

双链小干扰RNA（siRNA）在多种类型细胞中介导特异性的基因沉默,这一现象的发现为深入研究单个基因的功能提供了重要的方法学基础,从而得到了广泛的应用.最近的文献报道了全基因组siRNA库的建立,为高通量基因功能分析和研究提供了新的方法,成为新的研究热点.小干扰RNA库可以用来筛选和研究介导细胞复杂表型和生物学过程的关键基因,通过建立一系列具有目的表型的细胞系,有可能对特定细胞信号调节通路进行更为全面的解析.本文综述了目前在siRNA建库方法方面的进展,并探讨了建立小干扰RNA库中的关键问题.     

Inhibition of Human UDP-Glucose Dehydrogenase Expression Using siRNA Expression Vector in Breast Cancer Cells

UDP-glucose dehydrogenase (UGDH) catalyzes two oxidations of UDP-glucose to yield UDP-glucuronic acid. Pathological over-production of extracellular matrix components may be linked to the availability of UDP-glucuronic acid, therefore UGDH is a potential therapeutic target. RNA interference (RNAi) has been adapted to knock down the expression of human UGDH. A UGDH siRNA plasmid was constructed using a pRNA-U6.1/Neo vector and transfected into breast cancer cells, ZR-75-1, with an efficiency of up to 50%. Western blot analysis showed that the UGDH expression was efficiently knocked down at protein levels by RNAi in ZR-75-1 cells.     

甘菊DFL::EGFP高效融合蛋白表达载体的构建

增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)是一种优化的突变型GFP,DFL是从甘菊中分离出的LFY基因的同源序列。为了研究DFL基因的功能和表达模式,研究利用小片段克隆法将linker序列插入到EGFP基因5′端启始密码子前面,在pBI121载体的CaMV35S启动子的3′端后面插入一段多克隆位点,成功地构建了pBI-DFL-EGFP表达载体。通过设计特异引物,利用PCR技术扩增得了到拟南芥LFY基因的启动子序列,用粘性末端PCR技术将pBI-DFL-EGFP表达载体中CaMV35S启动子替换成LFY基因启动子,构建成了pLFY-DFL-EGFP表达载体。用含有pBI-DFL-EGFP和pLFY-DFL-EGFP质粒的农杆菌侵染洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下分别用蓝光激发,均观测到了荧光。这一结果表明,融合蛋白DFL∷EGFP表达载体构建成功,同时还证明了通过PCR技术克隆到的LFY启动子序列具有启动子功能。