条斑紫菜藻胆蛋白提纯方法优化探索

采用溶胀法与组织捣碎法相结合的紫菜叶状体细胞破碎方法.研究了不同物液比、缓冲液浸泡时间和硫酸氨盐析次数对藻胆蛋白纯度和产率的影响,对比了各种羟基磷灰石的层析效果,并对所得藻红蛋白和藻蓝蛋白做了吸收光谱、荧光发射光谱和SDS-PAGE鉴定.结果表明,在物液比为1:5,浸泡时间为36h时,紫菜综合破碎效果最佳;经过4次硫酸氨盐析后,藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度最高,分别达到1.71和0.98,采用Siegelman的方法制备的羟基磷灰石一次层析所得藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度最高,分别达到4.73和4.42,产率分别为0.144%和0.042%,且光谱和电泳鉴定结果均达到商品化要求.     

条斑紫菜R-藻红蛋白提纯工艺研究

对条斑紫菜叶状体R-藻红蛋白提纯方法进行了研究和分析。首先分别采用冻融法、化学试剂法、溶胀法等单一及组合细胞破碎方法对条斑紫菜细胞进行破碎,结果表明溶胀 组织捣碎法效果最佳。其次用25%～60%饱和度范围内的硫酸铵沉淀法粗提藻红蛋白,发现25%～45%硫酸铵分步沉淀法效果最好,再经结晶法盐析纯度(D565nm/D280nm)达到2.088。盐析液用SephadexG-25层析柱脱盐,再经羟基磷灰石(HA)柱层析,纯度可达到4.98。R-藻红蛋白的最大吸收峰在565nm,其室温荧光发射峰为578nm。SDS-PAGE结果显示,R-藻红蛋白可分为α、β两个亚基,Mr分别为17.0×103和19.0×103。     

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白逐级放大的纯化工艺

采用“破碎-盐析-层析”的方法纯化条斑紫菜藻胆蛋白,并在提取规模上逐步放大。首先在综合比较凝胶层析去盐效率后,从Sephadex G-25、G-100、S-300和CL-6B中选择G-25作为实验流程中的去盐填料,其次将提取流程的初试原料条斑紫菜量逐步放大,选取了1g、20g和400g三个量,结果表明随着初试紫菜量逐步放大,最终所得藻胆蛋白中吸收光谱纯度>3.2的蛋白产率依次提高,其中400g冻干紫菜的藻红蛋白产率为0.323％,藻蓝蛋白产率为0.148％。由此认为该实验工艺流程具有规模放大的潜力,这为高纯度藻胆蛋白的规模生产提供了一条可行的方案。     

坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基基因的原核表达与鉴定

通过PCR的方法从重组质粒pMD-apcAB中扩增坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基基因(apcA),并将其克隆到高效表达外源基因的原核表达质粒pTO-T7。将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western-blot和质谱鉴定。结果显示:apcA全长486bp,表达的α亚基(apcA)为带有原核表达载体T7g10的12个起始氨基酸的融合蛋白,其分子量约为19.7KD。0.5mmol/L的IPTG在37℃诱导6h时,apcA的表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上。Western-blot和质谱鉴定的结果表明获得的融合蛋白为重组坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基。       

坛紫菜中别藻蓝蛋白的纯化及洗脱组分光谱研究

以福建省平潭县坛紫菜(Porphyra haitanensis)为材料,采用硫酸铵分级分离和柱层析法纯化别藻蓝蛋白(APC),并对纯化的条件进行了详细的探讨。研究结果表明:采用30%~35%饱和硫酸铵沉淀、Tris-HC l(pH=8.0)作为洗脱缓冲液、DEAE-Sephadex-A-50作为层析介质,所获得的APC的纯度和回收率分别为3.50和70.2%;SDS-PAGE表明APC有α和β两个亚基,分子量分别为18.9 kD和17.7 kD。因此该方法对于从坛紫菜中快速纯化APC是适合的。采用光谱分析研究柱洗脱组分,结果表明:坛紫菜中含有分子结构为(αβ)6γ的“双峰型”R-PE,含有结构为(αβ)3的R-PC,含有结构为(αβ)3的APC-Ⅱ。     

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白α和β亚基基因序列测定及分析

为了获得江苏吕泗的条斑紫菜藻红蛋白α(Pea)和β(Peb)亚基、藻 蓝蛋白α(Pca)和β(Pcb)亚基基因的DNA序列,本文对其基因进行了克隆、 序列测定及分析.根据已发表的基因序列(DQ666487.1)设计引物,对提取自 条斑紫菜叶状体的DNA进行PCR和电泳鉴定,产物经测序证实获得藻红蛋白 序列1 357 bp (HM008263.1)和藻蓝蛋白序列1 335 bp (HM008262.1).上述 两段序列与已报道的条斑紫菜相关序列(DQ666487.1)同源性均为99％,与 其它几种紫菜相关序列同源性为88％～98％.两段序列均采用多顺反子转录 策略,排布顺序为5′Untranslated Regions(UTR)- Peb -间隔区- Pea -3 ′UTR 和 5′UTR- Pcb -间隔区- Pca -3′UTR.文中对基因翻译所得氨基 酸序列做了理化参数、功能位点及空间构型的预测.基于对序列开放阅读框 、启动子、Shine-Dalgarno (SD)序列的分析,本文对条斑紫菜分类地位进 行了讨论.     

红藻条斑紫菜R—藻红蛋白晶体的时间分辩偏振荧光研究

本文在皮秒时域内研究红藻条斑紫菜Ｒ－藻红蛋白单晶在不同晶轴取向下的偏振荧光动力学过程。荧光衰减减表现为二指数过程,即与色素之间的能量传递和激平衡有关的快过程和色素荧光跃迁过程;由于色素间的能量传递,荧光明显退偏振;由于晶体中色素的光学跃迁距取向倾向于沿主晶轴方向分布,在不同的晶轴的取向下各向异性荧光衰减过程明显不同。     

条斑紫菜中R－藻红蛋白的生化特性

条斑紫菜的Ｒ－藻红蛋白（Ｒ－ＰＥ）,在ＣＭ－５２柱上用含８ｍｏｌ／Ｌ脲的０．０２ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵缓冲液（ｐＨ＝５．０５）洗脱,观察到３条色带,经吸收光谱测定表明,它们分别是α、β、γ亚基。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定的α、β和γ亚基分子量分别是１７．０ｋｄ,１８．０ｋｄ和３１．７ｋｄ。Ｒ－ＰＥ中亚基的摩尔比是６α：６β：１γ。条斑紫菜的Ｒ－ＰＥ最稳定的聚集态分子量是２２９ｋｄ。各亚基的发色团含量：α亚基含２个藻红胆素（ＰＥＢ）,β亚基含１个ＰＥＢ和０．５个藻尿胆素（ＰＵＢ）,γ亚基含２个ＰＥＢ和３个ＰＵＢ。结合Ｒ－ＰＥ和各亚基的氨基酸组成分析,条斑紫菜的Ｒ－ＰＥ亚基组成是（αβ）６γ。     

Purification of R‐phycoerythrin from Porphyra haitanensis (Bangiales,Rhodophyta) using expanded‐bed absorption1

R‐phycoerythrin (R‐PE) was purified from leafy gametophyte of Porphyra haitanensis T. J. Chang et B. F. Zheng (Bangiales, Rhodophyta) by a simple, scaleable procedure. Initially, phycobiliproteins were extracted by repeated freeze‐thaw cycles, resulting in release from the algal cells by osmotic shock. Next, R‐PE was recovered by applying the crude extract with a high concentration of (NH₄)₂SO₄ salt directly to the expanded‐bed columns loaded with phenyl‐sepharose. An expanded‐bed volume twice the settled‐bed volume was maintained; then low (NH₄)₂SO₄ concentration was used to develop the column. After two rounds of hydrophobic interaction chromatography (HIC), R‐PE was purified by anion‐exchange column. The method was also successful with free‐living conchocelis of P. haitanensis. The purified R‐PE was identified with electrophoresis, and absorption and fluorescence emission spectroscopy. The results were in agreement with those previously reported. The yield with a spectroscopic purity (OD₅₆₅/OD₂₈₀) higher than 3.2 (the ratio of A₅₆₅/A₆₂₀ ≤ 0.02) was 1.4 mg · g^?1 of leafy gametophyte of P. haitanensis. For the free‐living conchocelis of P. haitanensis extract, R‐PE could be purified successfully with only one round of HIC. The yield with a spectroscopic purity (OD₅₆₅/OD₂₈₀) higher than 3.2 (the ratio of A₅₆₅/A₆₂₀ ≤ 0.02) was 5.0 mg · g^?1 of free‐living conchocelis of P. haitanensis. The method described here is a scaleable technology that allows a large quantity of R‐PE to be recovered from the unclarified P. haitanensis crude extract. It is also a high protein recovery technology, reducing both processing costs and times, which enhances the value of this endemic Porphyra of China.     

Isolation and characterization of microsatellite loci from a commercial cultivar of Porphyra haitanensis

Here we report 11 polymorphic microsatellite loci obtained from Porphyra haitanensis through an enriched genomic library. The analysis of 22 individuals from conchocelis phase of P. haitanensis, which possess a diploid nuclear phase, showed that allelic diversity range from three to six alleles. The polymorphism revealed by these loci will be extremely useful for genetic mapping, marker‐assistant selection, germplasm characterization and evolutionary studies in Porphyra.     

坛紫菜凝集素的糖结合专一性和细胞凝集作用

坛紫菜的磷酸盐缓冲液浸取液,经硫酸铵沉淀和DEAE－Sepharose,SephadexG-100二步层析纯化,获得纯化的坛紫菜凝集素（PHL）。该凝集素能与3种单糖（阿拉伯糖,半乳糖,木糖）及麦芽糖专一性结合,其中与麦芽糖结合最强。细胞凝集实验结果显示,PHL能凝集兔,绵羊及鸡红细胞而不能凝集鸭,鸽子及人血红细胞,PHL还能凝集海洋微藻－绿色巴夫藻和淡水微藻－蛋白核小球藻,它们的凝集活性与藻细胞密度有关。不同状态的细菌和酵母细胞对PHL反应不同,表明随着细胞状态的改变,细胞表面的凝集素受体也随之发生变化。     

坛紫菜hsp70基因真核表达载体的构建与转化

坛紫菜是极具经济效益的大型海藻,生活在环境多变的潮间带,易受到温度、渗遗压和辐射等因素剧烈变化的影响,经常处于逆境胁迫中.热休克蛋白70(HSP70)是生物体内一种重要且高度保守的应激因子,作为分子伴侣在胁迫条件下首先被诱导出来,在逆境胁迫调节中起着重要的作用.构建紫菜hsp70基因真核表达体系对于了解该基因在紫菜抗逆过程中的作用有重要意义.利用PCR技术扩增得到大小为1.89 kb的坛紫菜hsp70基因,将其克隆至pMD18-T载体上测序.从测序正确的菌株中提取质粒,经限制性内切酶Sma Ⅰ和Not Ⅰ进行消化,将目的基因与真核表达质粒p181AINE连接,获得重组真核表达质粒p181-hsp70.通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,结果表明重组真核表达质粒p181-hsp70构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电激转入酿酒酵母中,酵母菌落PCR结果显示电激转入成功.     

坛紫菜叶状体的无菌化培养及其应用

对坛紫菜叶状体的无菌处理方法进行了优化,并利用紫菜外生菌对无菌处理后的紫菜叶片进行了人工感染。经0.7%KI和0.1%(w/v)氨苄青霉素对紫菜叶片进行预处理后,利用氨苄青霉素、硫酸链霉素、新霉素、庆大霉素及卡那霉素等5种抗生素及其不同组合对紫菜叶片进行处理,筛选出最佳抗生素组合、浓度和培养条件。结果表明:氨苄青霉素(终浓度300μg/mL)、卡那霉素(终浓度100μg/mL)与庆大霉素(终浓度100μg/mL)3种抗生素组合对坛紫菜叶状体进行无菌处理18 h,对紫菜细胞的毒害较小,并且3种抗生素合用对89.5%紫菜外生细菌的抑菌率达80%以上;外生菌感染结果研究表明:用105/mL真菌孢子液和细菌菌液回染紫菜,培养22 d后,实验组紫菜生长状况较对照组好,对照组紫菜出现褪色。用108/mL真菌孢子液分别回染健康紫菜、穿刺紫菜(用灭菌刀片在紫菜表面划1～2 mm的伤口),分别在18℃、28℃和35℃条件下培养。实验结果表明28℃和35℃高温和穿刺均会影响无菌紫菜健康生长,且加菌紫菜在高温和穿刺条件下,则会出现明显病斑,而18℃培养的加菌紫菜则生长良好。     

坛紫菜菌解液对植物生长和抗性指标的影响

利用琼胶降解菌处理坛紫菜粉末,降解其细胞壁多糖,释放内容物,并获得菌解液,研究不同稀释度坛紫菜菌解液对受体植物蚕豆出芽和生长,以及大豆和番茄幼苗抗性相关指标的影响.结果显示:(1)随琼胶降解菌处理时间的延长,菌解液中还原糖含量逐渐增高.(2)3.33%的菌解液对蚕豆种子萌芽促进效果最好,而2%的菌解液能增加蚕豆叶绿素含量,促进其幼苗生长.(3)3.33%的菌解液能有效提高大豆离体子叶的植保素含量,迅速增加番茄叶片表皮条的H2O2的释放量,提高苯丙氨酸解氨酶活性.研究表明,琼胶降解菌能使坛紫菜细胞壁中的营养物质释放,并产生某些激发物质,从而使坛紫菜菌解液能够促进受体植物的种子发芽和幼苗生长,并能有效诱导植物的抗性.