猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫细胞中的表达及其特性

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将圆环病毒2型的ORF2全基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac^TM1中,获得重组转移载体pFast-OFR2,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用,经蓝白菌落筛选得到含ORF2基因的重组穿梭载体Bac-ORF2,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染sf9细胞,获得重组病毒,命名为Ac-ORF2。间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使Ac-ORF2感染的sf9昆虫细胞呈强的荧光着色; SDS-PAGE与Western-blotting分析可见大小约为28kD的特异性带,表明Ac.ORF2在sf9细胞中成功表达了PCV2-ORF2蛋白。将该表达蛋白纯化并经磷钨酸负染后,通过电镜观察可见形态与PCV2病毒粒子相似的病毒样颗粒(VLPs),其中某些颗粒由于中心浓染而似空衣壳,其直径也为17nm左右。     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

柯萨奇病毒A5病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定

目的构建柯萨奇病毒A5(coxsackievirus A5, CV-A5)病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),并对其进行纯化和鉴定。方法①将CV-A5 P1和3CD基因序列根据昆虫细胞密码子偏好性,对CV-A5-3487R4/CHN XY/2017株基因进行优化并合成,然后分别克隆至供体质粒pFastBacDual的多角体蛋白启动子(polyhedrin promotor, pPh)和pPl0启动子后,构建pFastBacDual-Pl/3CD重组质粒;②重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli,)DH10 Bac~(TM)中,转座形成重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid, bacmid);③再将重组bacmid转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒并表达CV-A5结构蛋白、组装VLPs。应用限制性酶切、PCR扩增、免疫荧光(immuno-fluorescence assay, IFA)技术对CV-A5 VLPs的蛋白进行鉴定;④再利用蔗糖垫底离心和氯化铯(CsCl)密度梯度离心的方法纯化CV-A5 VLPs,并用SDS-PAGE、Western Blot和透射电镜法进一步检测CV-A5 VLPs的浓度和纯度及颗粒形态。结果 pFastBacDual-P1/3CD重组质粒经限制性双酶切、重组Bacmid PCR鉴定、rCV-A5 VLs PCR鉴定结果显示,均在预期目标处有清晰条带。利用IFA检测重组病毒rBacCV-A5-P1/3CD蛋白,结果可见明显荧光。rCV-A5 VLPs经SDS-PAGE检测到VP0为39 000、VP1为34 000和VP3为27 000;Western Blot检测也可见相应特异性条带。利用透射电镜观察纯化rCV-A5 VLPs,可见直径为23～33 nm的颗粒,形态和大小均与CV-A5一致。结论成功构建了rBacCVA5-P1/3CD重组病毒,并在sf9细胞内成功表达了CV-A5 VLPs,为今后CV-A5 VLPs疫苗的研发奠定了基础。     

两株田间重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定、进化分析及其致病性研究

为了解2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV2)田间毒株重组特征,本研究对两株分离物(HENXX-8、HENJY-2)进行全基因测序、进化分析及毒力测定,并对其全基因序列进行重组分析。结果显示,两个毒株均属于PRRSV 2,两者与其代表株VR-2332的核苷酸相似性分别为85.6%、85.7%;与高致病性PRRSV(HPPRRSV)毒株JXA1、TJ和WUH4株分别为85.7%～85.8%、85.4%～85.5%;与经典毒株CH-1a、HB-2(sh)分别为84.7%～85.7%、84.5%～85.7%;而与所有NADC30类毒株均在90.0%以上。全基因、ORF5及Nsp2序列进化分析结果均显示两个分离物与国内报道的类NADC30毒株遗传距离较近,同处于一个分支。全基因组重组分析结果表明,两个分离毒株存在明显重组现象,且重组模式均以类NADC30毒株为骨架病毒,与HP-PRRSV毒株发生重组。但重组对象不同:HENJY-2是由类NADC30毒株与TJ株发生重组;而HENXX-8则是由类NADC30毒株与WUH4、TJ株发生3毒株间重组。由于重组部位序列缺乏特异性分子标志,因此无法确定与类NADC30发生重组的是HP-PRRSV还是其减毒的疫苗毒株。两株分离物的重组部位与早期分离毒株HENANHEPB、JL580等有所不同,均未涉及到ORF5基因,而是集中在Nsp1～Nsp2以及ORF2a～ORF3区域,主要发生在病毒基因组的靠5'端(30～7 000 bp)和3'端(11 000～13 000 bp)处。对部分重要基因的核苷酸相似性分析结果显示,两个分离株的ORF2a、ORF3基因与HP-PRRSV毒株相似性最高,表明重组病毒的这两个基因可能来自HPPRRSV毒株。致病性试验结果表明,参考毒株HENXC-4的毒力略高于分离毒株HENXX-8,主要表现在体温升高、日均增重降低和肺部病变上。但两个分离物均未引起发病猪死亡。以上结果表明,目前PRRSV2在田间的基因重组事件存在随机性,提示不同毒株在田间的存在会加剧PRRSV重组事件的发生和流行、毒株类型更加复杂,从而增加了临床防控难度。因此,慎重使用活疫苗并持续监测活疫苗毒株在田间的变异动态,对更好防控本病具有一定的临床指导意义。     

新城疫病毒7793 HN蛋白在昆虫SF9细胞中的表达研究

本实验对新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV) 7793 HN蛋白在杆状病毒表达系统中表达进行研究。提取病毒RNA并将其逆转录成cDNA,经PCR同义点突变在HN基因片段中加入NcoⅠ/XhoⅠ酶切位点,通过该酶切位点将HN基因克隆至穿梭载体p FastBac1质粒以构建重组质粒pFastBac1HTB-HN,然后用脂质体转染pFastBac1HTB-HN杆粒至昆虫SF9细胞。28℃无菌培养含pFastBac1HTB-HN杆粒的SF9细胞48 h,收集细胞培养上清液中的第一代病毒,感染SF9细胞,置28℃无菌培养60 h,收集细胞培养上清液,离心去除细胞碎片,取上清液中的第二代病毒,继续感染SF9细胞,置28℃无菌培养72 h,收集SF9细胞,用SDSPAGE和Western blotting验证HN蛋白的表达。SDS-PAGE和Western blotting均显示HN杆粒感染的SF9细胞成功表达了HN蛋白。本研究结果为进一步研究NDV7793-HN蛋白的抗肿瘤作用提供可靠试验依据。     

重组猪肺表面活性蛋白A在体外可抑制PRRSV感染宿主细胞

【目的】研究重组猪肺表面活性蛋白A(SP-A)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的抑制作用。【方法】采用PCR方法从含有猪SP-A基因的质粒中扩增SP-A基因,并将其插入到含有人CD5信号肽序列的真核表达载体pcDNA3.1A-CD5中,构建成SP-A基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5-SPA/MH。将重组表达载体通过磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western blot方法鉴定表达产物,采用Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析法从培养基中分离和纯化重组SP-A蛋白,通过ELISA方法检测SP-A蛋白与PRRSV的结合活性。将SP-A蛋白与PRRSV孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,感染72 h后测定病毒滴度,分析重组SP-A蛋白对PRRSV感染的抑制作用。【结果】结果表明构建的真核表达载体能够介导SP-A基因在HEK293T细胞中进行分泌表达;表达的重组猪SP-A蛋白能够与PRRSV进行剂量依赖性结合;用重组猪SP-A蛋白与PRRSV进行孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,结果显示SP-A处理的PRRSV感染细胞后的病变程度明显低于对照组。感染72 h后,SP-A处理组的PRRSV在MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞的滴度明显低于SP-A非处理组。【结论】重组猪SP-A在体外对PRRSV的感染有明显的抑制作用,揭示SP-A具有抗PRRSV的活性。     

共表达PRRSV修饰的GP5与M蛋白的重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建及其生物学特性

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)修饰的ORF5(MORF5)与ORF6基因分别克隆入笔者构建的改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified vaccinia virus ankara, MVA) 转移载体pLR-gpt的两个多克隆位点中, 构建重组转移载体pLR-MORF5/ORF6。经脂质体介导, 将构建好的pLR-MORF5/ORF6 转染已感染亲本MVA 2h的BHK-21细胞单层, 用药物选择性培养基(MXHAT)在24孔板上进行连续筛选纯化, 得到带有筛选标记的重组病毒rMVAgpt-MGP5/M。将rMVAgpt-MGP5/M 感染表达Cre重组酶的BHK-21细胞(BHK-Cre), 获得删除筛选标记的重组病毒rMVA-MGP5/M。PCR证明MORF5与ORF6成功插入MVA基因组中; Western blotting与间接免疫荧光证明重组病毒能表达MGP5与M蛋白; 重组病毒的生长特性表明与亲本MVA出现病变的时间及病毒滴度基本一致。结果表明, 本研究成功构建了共表达PRRSV MGP5与M蛋白的重组MVA, 并且表达产物具有免疫原性; 外源基因的插入不影响MVA复制, 具较好的稳定性, 从而为PRRSV新型基因工程疫苗的研制奠定了良好的基础。     

共表达PRRSV修饰的GP5与M蛋白的重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建及其生物学特性

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)修饰的ORF5(MORF5)与ORF6基因分别克隆入笔者构建的改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified vaccinia virus ankara, MVA) 转移载体pLR-gpt的两个多克隆位点中, 构建重组转移载体pLR-MORF5/ORF6。经脂质体介导, 将构建好的pLR-MORF5/ORF6 转染已感染亲本MVA 2h的BHK-21细胞单层, 用药物选择性培养基(MXHAT)在24孔板上进行连续筛选纯化, 得到带有筛选标记的重组病毒rMVAgpt-MGP5/M。将rMVAgpt-MGP5/M 感染表达Cre重组酶的BHK-21细胞(BHK-Cre), 获得删除筛选标记的重组病毒rMVA-MGP5/M。PCR证明MORF5与ORF6成功插入MVA基因组中; Western blotting与间接免疫荧光证明重组病毒能表达MGP5与M蛋白; 重组病毒的生长特性表明与亲本MVA出现病变的时间及病毒滴度基本一致。结果表明, 本研究成功构建了共表达PRRSV MGP5与M蛋白的重组MVA, 并且表达产物具有免疫原性; 外源基因的插入不影响MVA复制, 具较好的稳定性, 从而为PRRSV新型基因工程疫苗的研制奠定了良好的基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白介导的E蛋白假型鼠白血病病毒的构建

利用RT-PCR法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5和ORF6基因,分别构建pcDNA-ORF5、pcD-NA-ORF5/6和pcDNA-ORF5-ORF6真核表达载体,磷酸钙共沉淀法瞬时转染293T细胞,48h后收集细胞,流式细胞仪检测,结果表明:PRRSV ORF5基因编码囊膜蛋白(E蛋白)能在在293T细胞表面表达,而由共表达M蛋白(ORF6基因编码的基质蛋白)介导的E蛋白的表达量比单独E蛋白表达量高,串联表达与单独E蛋白相比较低.将pcDNA-ORF5、pcDNA-ORF5/6和pcDNA-ORF5-ORF6分别与MuLV假病毒构建体系的两种骨架载体pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHITlll(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染293T细胞,48h后收集假病毒上清,超速离心后通过Western blot证实E蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,证明E蛋白已整合到此假病毒粒子表面.将整合PRRSVE蛋白的假病毒粒子分别感染Marc-145和PAM宿主靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,结果表明:所构建的假病毒粒子具有感染性,且由M蛋白介导的MuLv-E/M感染性比MuLV-E假病毒感染性高.     

表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

广州地区GII.4 Sydney 2012[P31]型诺如病毒GZ2013-L10毒株病毒样颗粒功能和免疫原性鉴定

【背景】诺如病毒(Norovirus,NoV)是全球范围内引起急性胃肠炎暴发的主要病原体之一,其中GII.4型通过不断变异在人群中持续存在并占据诺如病毒感染的主导地位,尤其GII.4 Sydney2012[P31]变异株自2012年出现以来在全球各地持续流行至今。【目的】制备广州地区GII.4 Sydney2012[P31]型诺如病毒毒株GZ2013-L10的病毒样颗粒(virus like particle,VLP),并系统表征其功能及免疫原性特点。【方法】从毒株GZ2013-L10中扩增ORF2基因并克隆构建重组转座载 PFastBac1-L10-ORF2,进一步转化至大肠杆菌DH10Bac构建重组杆状病毒质粒,进而在昆虫细胞sf9中表达病毒样颗粒并通过超速离心纯化,最后经透射电镜、Western blotting和受体结合实验对病毒样颗粒进行表征。此外,将免疫小鼠获得的病毒抗血清通过间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和受体结合阻断试验进行验证。【结果】成功构建了重组杆状病毒质粒Bacmid-L10-ORF2并获得病毒样颗粒,电镜结果表明病毒样颗粒直径约为30 nm,SDS-PAGE和Western blotting显示蛋白大小约为58 kDa。受体结合实验结果显示,病毒样颗粒能与A/B/O等分泌型唾液受体及猪胃黏膜蛋白结合,而与非分泌型唾液受体均不结合。免疫小鼠获得效价为1.3×105的抗血清,但ELISA结果显示其与不同基因型诺如病毒衣壳蛋白无交叉免疫活性。此外,抗血清对同型病毒样颗粒具有受体中和阻断作用,但对不同型别病毒样颗粒(包括GII.8、GII.17和GII.3)无中和效果。【结论】本研究制备并系统表征了广州地区GZ2013-L10毒株的病毒样颗粒及其抗血清,其研究结果可为解析其流行原因以及疫苗研发提供参考。     

乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒表面抗原密度对抗体应答水平的影响

【目的】为了探究乙肝病毒核心蛋白(HepatitisBviruscoreprotein,HBc)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)表面抗原密度对免疫后抗体应答水平的影响,制备了不同抗原密度的HBc VLPs疫苗,并检测了其在小鼠体内的抗体应答水平。【方法】首先制备了N端带有3个甘氨酸的人巨细胞病毒重组抗原域AD-4作为模式抗原,接着通过Sortase A的介导将AD-4连接到HBc VLPs表面上。将系列浓度梯度AD-4抗原在SortaseA介导下分别与相同浓度的HBcVLPs发生反应,制备不同抗原密度的HBc-AD-4 VLPs。将其分别免疫6–8周龄BALB/c小鼠3次,每次免疫间隔2 w,间接ELISA法检测被免疫小鼠血清的抗体应答水平。【结果】结果表明,当HBc VLPs表面抗原密度为44.4%时,即HBc反应浓度∶AD-4反应浓度为1:0.5时,不足以引起高滴度的抗体产生;当HBc VLPs表面抗原密度为64.2%时,即HBc反应浓度∶AD-4反应浓度为1:1时,HBc-AD-4 VLPs诱导的AD-4特异性抗体滴度与100%抗原密度的HBc-AD-4VLPs所引起的抗体滴度相当;当HBcVLPs表面抗原密度大于64.2%时,引起的抗体应答水平不因抗原密度增加而进一步增强。【结论】发现了HBcVLPs表面抗原密度与免疫后抗体滴度呈正相关,然而免疫64.2%抗原密度的HBc VLPs所产生的抗体滴度可达峰值,抗原密度进一步增加,抗体应答水平不会进一步加强。     

An Attenuated Highly Pathogenic Chinese PRRS Viral Vaccine Confers Cross Protection to Pigs against Challenge with the Emerging PRRSV NADC30-Like Strain

A novel PRRSV strain was isolated in China that was genetically similar to the NADC30 strain which is reported to have spread throughout China. The objective of the present study was to evaluate the cross-protective efficacy of the live vaccine TJM-F92 in young pigs against challenge with a NADC30-like strain, HN201605. Twenty-five PRRSV- and antibody-free pigs were randomly divided into the following five groups: Vac/ChA, Unvac/ChA, Vac/ChB, Unvac/ChB and the mock. The pigs in groups Vac/ChA and Vac/ChB were inoculated intramuscularly with 1 mL TJM-F92 (10^5.0 TCID₅₀/mL). At 28 days post vaccination (0 days post challenge), groups Vac/ChA and Unvac/ChA were inoculated intranasally with 10^4.5 TCID₅₀/mL PRRSV strain TJ F3 (2 mL/pig), while groups Vac/ChB and Unvac/ChB were inoculated, using the same route, with the same dose of the NADC30-like strain HN201605 F3. Protective effects of the PRRSV strain were observed in all pigs in the Vac/ChA and Vac/ChB groups. Neither high fever nor signs of clinical disease were observed through the experiment in these groups, whereas pigs in Unvac/ChA group exhibited serious clinical symptoms, pathological lesions, and weight loss. In Unvac/ChB group, pigs developed milder clinical symptoms, which demonstrated that the NADC30-like strain HN201605 had moderate pathogenicity. The results suggest that the MLV vaccine strain TJM-F92 is an effective and safe vaccine candidate for use in China.     

新型鸭细小病毒样颗粒的制备及鉴定

【背景】鸭短喙侏儒综合征(beak atrophy and dwarfism syndrome, BADS)是由新型鸭细小病毒(novel duck Parvovirus, NDPV)感染导致雏鸭生长发育迟缓、上下喙萎缩的疾病。BADS的暴发给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。【目的】利用大肠杆菌表达系统制备NDPV病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),为研制NDPV相关疫苗奠定基础。【方法】对NDPV VP2序列全长进行密码子优化、合成,连接至pColdTF表达载体,获得pColdTF-NDPV-VP2重组质粒,酶切、测序鉴定正确后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)对蛋白表达进行可溶性分析;使用凝血酶(thrombin)切除trigger factor (TF)标签,利用镍柱(Ni-NTA)亲和层析方法纯化重组蛋白;利用Western blotting对纯化后的VP2蛋白进行反应原性分析;利用透射电镜、动态光散射观察重组蛋白形态以及能否形成VLPs。【结果】构建了pColdTF-NDPV-VP2重组质粒,在大肠杆菌中主要以可溶性形式表达,融合蛋白TF-VP2大小约为115 kDa,去除TF标签经镍柱纯化后得到67 kDa的VP2蛋白;Western blotting试验表明VP2蛋白能与NDPV鸭阳性血清发生特异性结合;通过透射电镜可以观察到形状规则、直径约为20−25 nm的病毒样颗粒。【结论】利用大肠杆菌表达系统制备了NDPV VLPs,为下一步研发BADS相关亚单位疫苗及生物相关制品提供了基础。     

PRRSV NADC30-like SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立高效快速的PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据NADC30毒株Nsp2基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性实验以及临床样品的检测。结果显示,标准品在10~7 copies/μL到10~2 copies/μL浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测浓度为2.25×10~1 copies/μL;该方法与HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV无交叉反应,批内和批间的变异系数(CV)小于1.9%,在临床样品的检测中较普通PCR有更高的检出率。建立了PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR检测方法,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于PRRSV NADC30-Like感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

Assembly and immunogenicity of baculovirus-derived infectious bronchitis virus–like particles carrying membrane,envelope and the recombinant spike proteins

Objective

To assemble infectious bronchitis virus (IBV)-like particles bearing the recombinant spike protein and investigate the humoral immune responses in chickens.

Results

IBV virus-like particles (VLPs) were generated through the co-infection with three recombinant baculoviruses separately encoding M, E or the recombinant S genes. The recombinant S protein was sufficiently flexible to retain the ability to self-assemble into VLPs. The size and morphology of the VLPs were similar to authentic IBV particles. In addition, the immunogenicity of IBV VLPs had been investigated. The results demonstrated that the efficiency of the newly generated VLPs was comparable to that of the inactivated M41 viruses in eliciting IBV-specific antibodies and neutralizing antibodies in chickens via subcutaneous inoculation.

Conclusions

This work provides basic information for the mechanism of IBV VLP formation and develops a platform for further designing IBV VLP-based vaccines against IBV or other viruses.

     

牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及其对豚鼠的免疫原性分析

为了获得预防牛病毒性腹泻病毒1型(bovine viral diarrhea virus 1,BVDV-1)感染的病毒样颗粒,扩增C-Ems-E1-E2编码区段并克隆至pFastBacDaul载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞与Bacmid重组获得Bacmid-BVDV-1,转染至Sf9细胞,获得重组杆状病毒B...     

T7噬菌体转运真核表达载体入胞表达平台的构建

[目的]构建携带锚定序列的真核表达载体,研究T7噬菌体识别、包裹和转运真核表达载体进入细胞实现蛋白表达的可行性,为DNA疫苗研发建立新的技术平台.[方法]本研究通过重叠延伸PCR方法获得候选锚定序列并插入真核表达载体;建立荧光定量PCR方法比较T7噬菌体识别、包裹真核表达载体的效率;激光共聚焦显微镜观察T7噬菌体转运真...     

埃博拉病毒GP和VP40蛋白在哺乳动物细胞中的共表达及病毒样颗粒装配

目的：制备基因重组埃博拉病毒样颗粒,为疫苗研究及埃博拉病毒特异抗原、抗体检测提供基础。方法：根据埃博拉病毒扎伊尔株的GP和VP40蛋白氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成GP和VP40基因片段并分别构建于表达质粒pcDNA3.1或同时构建到具有双表达单元的质粒pBudCE4.1;重组质粒经lipofectamine2000转染293FT细胞;以Western blot检测重组蛋白GP和VP40的表达;通过电镜观察病毒样颗粒。结果：构建的重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功;Western blot结果显示,共转染分别表达GP和VP40的两个质粒或转染共表达两个蛋白的质粒都发现GP特异反应条带产生,且大小与预期相符,此外,转染共表达质粒产生的GP蛋白表达明显强于两个质粒共转染,并同时可检测到VP40的表达;电镜观察到典型的丝状的埃博拉病毒样颗粒。结论：在293FT细胞中基因优化的埃博拉病毒GP和VP40可有效表达并装配为病毒样颗粒,为进一步研究奠定了基础。     

Use of Rotavirus Virus-Like Particles as Surrogates To Evaluate Virus Persistence in Shellfish

Rotavirus virus-like particles (VLPs) and MS2 bacteriophages were bioaccumulated in bivalve mollusks to evaluate viral persistence in shellfish during depuration and relaying under natural conditions. Using this nonpathogenic surrogate virus, we were able to demonstrate that about 1 log₁₀ of VLPs was depurated after 1 week in warm seawater (22°C). Phage MS2 was depurated more rapidly (about 2 log₁₀ in 1 week) than were VLPs, as determined using a single-compartment model and linear regression analysis. After being relayed in the estuary under the influence of the tides, VLPs were detected in oysters for up to 82 days following seeding with high levels of VLPs (concentration range between 10¹⁰ and 10⁹ particles per g of pancreatic tissue) and for 37 days for lower contamination levels (10⁵ particles per g of pancreatic tissue). These data suggest that viral particles may persist in shellfish tissues for several weeks.