利用人工核酸酶构建基因编辑猪的研究进展

猪不仅具有重要的农业生产价值,由于猪繁殖周期比灵长类动物短,产仔量多,以及猪器官大小、生理代谢过程和解剖结构,尤其是心血管系统及神经系统较啮齿类动物而言与人类更为接近,猪在生物医药领域也具有重要的用途。对猪基因组加以编辑,在农业上可以加速高生产性能猪新品种的培育;在生命科学领域可用于基因功能、胚胎发育及代谢过程等基础研究;在医学上,可提供与人体更为匹配的异种移植器官,可作为更能准确模拟人类疾病的大动物模型,用于新的药物和治疗手段的开发。人工核酸酶的出现,使基因编辑效率得到大大提高,克服了原有的基因编辑猪制备困难、成功率极低的问题。人工核酸酶技术不仅在猪上实现了高效而又精确的基因编辑,并且使各种基因突变模式,如基因敲除、基因敲入、基因组无痕点突变、多基因编辑、体内直接基因编辑以及条件性基因编辑等都成为可能。现将对利用不同人工核酸酶技术结合不同的基因编辑策略建立基因编辑猪的研究新进展进行综述。     

基因修饰工具猪模型的建立及应用

基因修饰工具动物模型是指对已知基因加以修饰建立的,能够作为工具,从而帮助实现其他目的基因修饰动物模型。工具动物模型在生物学研究和生物医药开发中具有非常重要的作用,尤其是基因修饰动物模型在基因功能和信号通路等生物学基础研究方面做出了突出贡献。猪不仅是重要的农业经济动物,由于猪在器官结构、大小以及生理代谢方面与人更加接近,因此,猪也是比较理想的生物医药大动物模型。近几年,由于基因编辑技术的突破,工具猪模型的建立取得了引人注目的进展,人们已先后培育出了细胞多能性示踪工具猪模型,如细胞谱系示踪工具猪模型,可用于重组酶介导的基因交换工具猪模型,免疫缺陷猪模型以及可用于体内基因编辑的基因修饰工具猪模型,这些工具猪已逐渐得到推广应用。本文重点拟对具有广泛用途的基因修饰工具猪模型的研究进展和应用进行综述。     

利用CRISPR-Cas9技术构建基因修饰哺乳动物模型的进展

基因修饰动物模型(genetically modified animal models)是研究个体发育过程和疾病中特定基因功能的一种重要工具,在研究人类疾病发生机制、病理生理和评估新药物、新治疗方法方面有重要应用。哺乳动物因其与人类的相似性而常被用来进行人类疾病研究和药物筛选。然而,传统构建基因修饰动物模型的同源重组等方法不仅需要培养的哺乳动物胚胎干细胞系,而且费时费力。近年来新出现的CRISPR-Cas9基因编辑系统可以在哺乳动物中实现快速、准确的基因定点修饰。该文将介绍CRISPR-Cas9系统在构建基因修饰哺乳动物模型中的应用。     

条件性RNA干扰技术研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由与靶基因同源的双链RNA引起的,具有序列特异性的转录后基因沉默技术。目前,RNAi已被广泛应用于基因功能的研究中。为了使基因沉默具有时空特异性,可以通过构建基于Cre重组酶的Cre/lox P系统、可被小分子药物诱导的Tet诱导系统以及两者组合形成的高级诱导RNAi系统来条件性的控制小发夹状RNA(sh RNA)的表达,使其靶基因的表达可受外界调控,在特定组织细胞中或者特定的生长发育时期被抑制,从而更好地进行基因功能研究。目前,条件性RNAi基因沉默策略具有多样化,精确性和组合式的特点。本文就条件性RNAi基因沉默技术的多元策略做一综述。     

GPR126条件性基因敲除载体的快速构建

基因敲除小鼠模型是在动物体内研究基因功能的重要和可靠的手段之一,而构建用于同源重组的基因敲除载体是构建基因敲除小鼠模型的关键一步.条件性基因敲除技术将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠的特定发育时期或特定类型的组织细胞中,通过加入具有位点特异性的重组系统,该修饰作用在时间和空间上均处于可调控的状态;条件性基因敲除技术既可以避免某些具有重要功能基因的敲除所带来的早期胚胎致死问题,还可用于精确分析某些多效基因在不同组织或不同发育阶段的特定功能差异.通过合理利用改良的Red重组系统,将两个LoxP位点快速准确地插入到了目标位置,实现了GPR126条件性基因敲除载体的快速构建,为后续的构建GPR126基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因的功能奠定了基础.     

非人灵长类基因修饰模型构建技术研究进展

随着以CRISPR-Cas9为代表的新型基因编辑技术的出现及发展应用,科学家们在构建非人灵长类基因修饰模型方面取得了很多重要进展。然而,首建动物嵌合、复杂基因修饰低效、传代周期长以及遗传背景复杂等多方面因素极大地限制了非人灵长类基因修饰模型的开发和应用。现对目前非人灵长类基因编辑模型构建的进展进行综述,并重点对基因编辑技术结合体细胞核移植、精原干细胞、胚胎干细胞及单倍体干细胞等技术手段在非人灵长类基因修饰模型构建中的进展进行综述和展望。     

基因编辑猴模型及其在基因治疗研究中的应用前景

基因编辑技术的开创性进展使得利用CRISPR技术建立猴模型并开展病变基因校正成为目前基因治疗研究领域的热点。非人灵长类与人类在进化关系上最为接近,在模型构建、疾病机制研究以及药物研发方面优势突出。随着基因修饰技术在非人灵长类上的逐步应用,目前已经构建出多种与临床患者病症高度吻合的疾病模型,为开展遗传疾病的基因治疗打下了坚实基础。然而,目前基因递送和基因修复系统面临巨大挑战,能否安全、高效、精确地修复致病基因是基因治疗临床转化的关键问题,现将综述基于猴模型开展基因治疗研究的前景及挑战。     

基因编辑技术在猪现代育种和动物模型构建中应用的研究进展

基因编辑技术是近几年兴起的一项能够对目标基因序列进行编辑的技术,该技术主要利用人工核酸酶实现对基因组上特定DNA片段的删除、插入或修饰。猪是我国优质的肉用型家畜,但随着人民生活水平的提高,对猪的需求也由过去的膘肥体重转变为能提供更优质的肉品,这就要求对猪的瘦肉率、肉质等主要经济性状方面进行育种改良,从而优化猪肉的蛋白质和脂肪含量。此外,由于猪在解剖学和生理学等方面与人类高度相似,可以用于疾病模型、药物筛选及致病机理的研究,基因编辑将在以上方面发挥显著的作用。利用基因编辑技术可以大大缩短猪在现代育种和疾病动物模型构建的时间,使猪在农业发展和生物医学研究中拥有更大的潜力。该文主要综述传统转基因技术和基因编辑技术在猪育种和动物模型构建中所采用的方法,并对比各种方法的优缺点,旨在为猪的育种和动物模型的构建提供理论依据。     

CRISPR-Cas9系统的基因编辑工具的应用和改进

基因编辑技术可以实现对特定目的基因的编辑,加速了基因功能的研究、疾病的研究与治疗、药物的开发等,是生命科学的重要研究手段。基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑工具可改变基因特定位点的序列、调控基因表达水平、敲除基因、改变特定位点表观遗传修饰以及活细胞成像等,成功应用于多种动植细胞系和模式生物。本文就基于Cas9的基因编辑工具的现状和相关改进展开综述。     

猪Nanog基因四环素诱导干扰载体的构建和鉴定

Nanog基因是在早期胚胎和干细胞等多能性细胞中特异表达的重要基因,但有关猪Nanog基因功能的相关研究甚少。四环素诱导干扰载体是一种可通过四环素等药物条件性诱导干扰目的基因的载体,尤其适用于在发育过程中起着关键作用的基因沉默。常规的四环素干扰系统为二元载体,与一元载体相比获得针对特定基因干扰的稳定细胞系所需周期更长。首先通过构建pGenesil 1.0-shRNA重组干扰载体,瞬时转染稳定过表达猪Nanog基因的猪胎儿成纤维细胞后通过Realtime-PCR筛选出干扰效率可达80%以上的干扰片段。之后将筛选得到的干扰片段插入到改造的一元四环素诱导干扰载体TREsilencer,对稳定表达猪Nanog基因的猪胎儿成纤维细胞进行了瞬时转染。实验分别通过光密度检测以及Realtime-PCR检测了不同浓度doxycycline的诱导效率和干扰效率。结果表明,所构建的四环素诱导干扰载体TREsilencer-shRNA5随着四环素浓度的增加,诱导Nanog基因的干扰效率增加,在处理浓度为1μg/ml时干扰效率可达70%以上,为后续得到可诱导的稳定干扰猪Nanog基因的细胞系和进一步研究猪Nanog基因功能奠定了基础。     

Cre-LoxP条件性基因敲除的实际应用策略

Cre-loxP系统是起源于P1噬菌体的高效重组系统,其根据loxP位点组合不同而发生特定重组的模式使其成为近年来基因编辑最常用的工具之一。本文聚焦于Cre-loxP系统的实际应用问题,首先分析了CRISPR/Cas9系统在插入Cre序列与loxP序列中的作用与优势,随后阐述了一系列Cre-loxP系统的实际应用问题。本文阐述了Cre重组酶序列的原位插入与安全位点插入的选用、loxP序列插入的策略、Cre重组酶的标签蛋白鉴定、“异位”表达的荧光鉴定、PCR鉴定法的引物设计与工具鼠的繁殖策略等。同时,介绍了Cre-loxP系统在条件性基因敲除中的优化应用,例如配体诱导型Cre、启动子激活型Cre、光诱导型Cre与活性改造型Cre等。通过这些优化应用,可以获得对条件性基因敲除的时间可控性,也可以调节Cre重组酶的活性,甚至可以规避Cre重组酶本身的毒性。最后,论述了Cre-loxP系统面临的缺陷与挑战,展望了未来Cre-loxP系统的发展方向。总而言之,本文综述了基于Cre-loxP系统的基因敲除的实际应用,总结了目前Cre-loxP系统最前沿的研究进展和优化策略,并对未来基于Cre-loxP系统的基因编辑进行展望。本文旨在提供解决基于Cre-loxP系统实际操作问题的理论指导,并为未来更精确、更可控、更具适应性的基因编辑提供新的研究思路。     

Production of a reporter transgenic pig for monitoring Cre recombinase activity

The pig is thought to be the most suitable non-human source of organs for xenotransplantation and is widely used as a model of human disease. Using pigs as disease models requires the design of conditional Cre recombinase-loxP gene modifications, which, in turn, requires a Cre-expressing pig with defined patterns of expression controlled by the use of a tissue-specific promoter. In order to monitor Cre recombinant expression in vivo, it is important to create a reporter strain. We have generated reporter a pig that is based on a single vector that drives the ubiquitous expression of the enhanced green fluorescent protein (EGFP). The EGFP gene is expressed only after Cre-mediated excision of loxP-flanked stop sequences. These reporter transgenic pigs will be of great value for monitoring Cre recombinase activity in vivo.     

CRISPR /Cas9基因编辑技术在山羊和绵羊中的应用研究进展

CRISPR/Cas9系统是近年来新兴的一种基因编辑技术,可将特定DNA基因序列敲除、插入或定点突变,具有快捷、高效、精准、特异性高等特点,广泛地应用于遗传育种、生物医药和基因工程等研究领域。山羊和绵羊是重要的经济家畜动物和实验动物,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对羊进行遗传修饰,将加速品种改良,提高动物生产性能,获得更加优质的农副产品。主要对CRISPR/Cas9基因编辑技术的概述、作用机理及在羊乳"人源化"改造、提高肉品质、改善毛纤维质量等方面的应用研究进展及发展前景作简要阐述,以期为相关科研人员提供参考。     

基因编辑技术研究进展及其在苜蓿等豆科饲草作物中的应用

基因编辑是对生物基因组进行靶向修饰的一项新型生物技术,可以在不同物种中实现对目标基因的定点敲除、基因片段置换以及基因定点插入等基因定向编辑,目前基因编辑技术已在植物基因功能解析和作物遗传改良研究中得到广泛应用。本文简要回顾基因编辑技术的发展历程,重点介绍新近发展的CRISPR/Cas9技术在植物中的研究进展,并对CRISPR/Cas基因编辑技术在苜蓿等饲草作物中的应用进行探讨和展望。     

人工核酸酶介导的基因组编辑技术

传统的基因组编辑技术是基于胚胎干细胞和同源重组实现生物基因组定向改造,但是该技术打靶效率低,严重制约了生命科学以及医学的研究.因此,研究新的基因组编辑技术十分重要.人工核酸酶介导的基因组编辑技术是通过特异性识别靶位点造成DNA双链断裂,引起细胞内源性的修复机制实现靶基因的修饰.与传统的基因组编辑技术相比,人工核酸酶技术打靶效率高,这对于基因功能的研究、构建人类疾病动物模型以及探索新型疾病治疗方案有着重要的意义.人工核酸酶技术有3种类型：锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子核酸酶(TALEN)及规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR).本文将对以上3种人工核酸酶技术的原理以及在生命科学和医学研究的应用进行综述.     

基因打靶技术:开启遗传学新纪元

基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基因的技术手段在揭示基因的生理功能、研究人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标的过程中发挥着重要的作用。近年来, 随着条件基因打靶技术的发展使基因失活可以限制在特定时段特定组织或细胞内。文章将主要介绍基因打靶技术的发展简史、近期进展以及在其他模式动物中的应用。     

毕赤酵母基因编辑技术研究进展

巴斯德毕赤酵母是一种重要的蛋白表达系统,基因编辑技术作为代谢工程的基本工具,对于毕赤酵母的代谢改造十分重要。近十年基因编辑技术发展迅速,除传统的同源重组和Cre/loxP重组外,相继出现了许多新的基因编辑技术,例如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等,这些技术的出现使基因编辑更加简便高效。本文对毕赤酵母中传统和新型基因编辑技术的原理应用和研究进展进行了简要综述,并结合相关领域的发展对毕赤酵母基因编辑技术的发展进行了展望。     

CRISPR/Cas9系统在疾病研究和治疗中的应用

基因组编辑技术(Genome editing technology)是一种通过人工手段在基因组水平对DNA序列进行改造的遗传操作技术,包括特定DNA片段的插入、敲除、替换和点突变.其中,依赖核酸酶的基因组编辑技术的基本原理是在基因组的特定位置产生双链DNA断裂(Double-stranded break,DSB)后通过...