抗体生产纯化技术进展

自1997年FDA批准第一个治疗淋巴癌的嵌合单抗药物Rituxan,Anti-CD-20抗体上市,并进入56个国家,至2007年,FDA已批准了20多种治疗性单抗药物,约一半用于治疗癌症（详见附录1）,多个已成为年销售额超十亿美元的“炸弹药物”（Blockbuster Drug,图1）。全球抗体药物的市场增长十分迅猛,有约200多种单抗在临床实验,占整个临床生物技术药品总数的三分之一多,     

抗体分离纯化技术的研究进展

制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败.抗体的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体.但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化.重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法.对当前的纯化方法进行了一个简要的综述.     

抗TNF-α单链抗体的表达及其纯化

克隆抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)鼠源单抗的可变区基因以构建其单链抗体(ScFv)表达载体,实现在大肠杆菌的表达,并进行ScFv的可溶性纯化与鉴定。采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因(VL,VH),构建ScFv基因,将ScFv基因片段与pGEX-4T-1表达载体连接,在大肠杆菌中表达并采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)进行可溶性纯化,最后鉴定其生物活性。结果显示,得到了功能性重排的轻、重链可变区基因,分别构建了VH和VL不同连接顺序的HLL(VH-Linker-VL)和LLH(VL-Linker-VH)两种ScFv,LLH的表达量较HLL的高,但亲和力不及HLL。采用Sarkosyl溶解包涵体,对目的蛋白进行可溶性纯化,蛋白纯度达到90%,纯化后的蛋白经ELISA和WB证明ScFv维持了亲本抗体与TNF-α特异性结合的能力,且具有细胞毒中和活性。实验中研究探索了一种新颖的,操作简单,省时的裂解、纯化方案,实现了单链抗体经原核系统的表达后得以可溶性纯化。     

抗P185工程抗体表达与纯化的研究

人类的原癌基因Her-2编码一个185kDa的跨膜受体酪氨酸激酶,也称为p185,是肿瘤相关蛋白,在多种癌细胞,特别乳腺癌中有高表达。本实验室构建了抗p185/HER-2的二价的嵌合抗体（scFv-Fc）,并证明其保留了亲本抗体的特异结合活性,进而建立了高表达的细胞株。本研究对该嵌合抗体进行滚瓶大规模培养,并对培养产物的纯化条件进行了摸索,建立了亲和层析和阳离子交换层析两步法。最终产物的纯度达到95％以上,回收率为63％。我们还摸索了嵌合抗体的冻干保存条件,抗体可以保持其稳定性和结合活性达一年以上。嵌合抗体纯化工艺和保存条件的确定,为进一步的临床研究奠定了基础。     

片段抗体纯化工艺的优化

以单克隆抗体为特异性载体标记放射性核素用于肿瘤病人的导向治疗 ,已取得很好的效果。用蛋白酶水解全抗体得到的Ｆ(ａｂ′) 2 片段 ,由于去除了Ｆｃ段 ,减小了人抗鼠异种蛋白排斥反应 ,具有分子量小 ,到达肿瘤部位迅速 ,血液本底和非瘤组织的清除快等优点 ,较之全抗体有更大应用潜力。但Ｆ(ａｂ′) 2片段性质不稳定 ,制备工艺复杂 ,采用旧的纯化工艺如分子筛、离子交换、亲和色谱[1～ 3] 等很难制备出符合临床应用质量标准的片段抗体。为此 ,我们在ＦＰＬＣ上建立了疏水作用色谱法纯化Ｆ(ａｂ′) 2 片段 ,取得了理想的结果。本文报道三组不…     

RAP蛋白的纯化和抗体制备

从04018金黄色葡萄球菌培养上清分离纯化获得相对分子质量为38000,具有激活RNAⅢ作用的RAP蛋白。用该蛋白免疫家兔得到效价为1：128000的多抗血清。纯化后的抗体可以特异结合RAP并抑制其激活RNAⅢ转录的作用。     

拟南芥MnSOD的原核表达、纯化及抗体制备

PCR扩增拟南芥MnSOD cDNA的保守区段,构建pET-SOD重组质粒,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导融合蛋白高效表达;经检测表达产物占菌体总蛋白的69％,且以不溶的包涵体形式存在;表达产物变性后经Ni—NTA Superflow亲和柱分离纯化,得到相对分子质量约为29000的PAGE纯蛋白。融合蛋白经还原复性处理后,比活达到200U／mg;免疫家兔制备MnSOD融合蛋白抗体,抗体效价为1：10000。以上结果为进一步大规模制备MnSOD及其功能研究奠定基础。     

抗人胃癌单链抗体的分离纯化及其活性测定

用已经构建的工程菌高效表达抗人胃癌链缺本并使用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱层析分离纯化抗体蛋白。同时用免疫竞争抑制实验,测出单链抗体具有特异性结合胃癌抗原活性。     

6C6鼠-人嵌合抗体的纯化及鉴定

采用基因工程技术 ,将小鼠 6C6单克隆抗体可变区基因与人抗体恒定区基因连接 ,构建了鼠 人 6C6嵌合抗体基因 ,并在CHO细胞中高效表达 .利用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化 6C6嵌合抗体 ,得到电泳纯度大于 98%的 6C6嵌合抗体 ,其重链 (5 5kD)和轻链 (2 4kD)符合IgG相对分子质量的理论值 .Western印迹、细胞免疫荧光和免疫组织化学实验结果均呈阳性 .表明6C6嵌合抗体可识别人乳腺癌细胞表面上的肿瘤相关抗原 ,保持了 6C6单克隆抗体的特性 ,为后续的研究工作奠定了基础     

玉米细胞质HSC70的分离纯化及其抗体的制备

依据某些热激蛋白对ATP具有高度亲和性的特性,介绍了用ATP-琼脂糖亲和柱结合电洗脱分离纯化玉米幼苗细胞质HSC70及制备兔抗HSC70多抗的方法.先采用ATP-琼脂糖亲和柱初步分离几种能与ATP结合的热激蛋白,后用SDS-PAGE,切下分子量为70 kD的电泳谱带,电洗脱后用以免疫新西兰兔,以ELISA法和Western blot检测抗体效价和特异性.     

用于抗体/抗体片段表达的系统及其高表达策略

随着诊断及治疗领域内单克隆抗体及片段的广泛应用,传统的杂交瘤生产技术已很难满足对其日益增长的需求。由于基因重组技术及生物工程技术的迅速发展及日益成熟,大规模生产单克隆抗体/片段已成为可能。对目前常用的载体及表达系统进行列举和比对,这些系统包括大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统。在第二部分,对提高表达产率的策略进行了探讨,其中包括:表达蛋白质本身的修饰(如蛋白融合、定点突变)、表达系统的选择、密码子优化、表达环境的优化和抗体体内表达等。最后,对抗体/抗体片段高表达的前景作了展望,认为生物信息学将在此领域发挥重大作用,并且相信建立高表达平台的时机已经来到。     

治疗性单抗与抗体产业关键技术

抗体技术历经动物血清多克隆抗体、杂交瘤单克隆抗体,以及重组基因工程抗体等不同发展时期,尤其是后者使得治疗性抗体的生产进入产业化阶段.在已上市的抗体药物中,人源化抗体、全人源抗体由于免疫原性小,临床药效好,目前已经成为抗体药物的主流.随着抗体药物在癌症、免疫调节等治疗领域的广泛应用.抗体产业已经成为国际制药行业的主要组成部分.我国的抗体产业由于品种不足、技术落后,尚处于起步阶段,其行业发展受限于诸多技术瓶颈,如:工程细胞系构建与筛选、大规模培养工艺开发,单抗的纯化与质控等,上述产业化关键技术的突破可加快我国抗体产业的发展进程.     

单克隆卵黄抗体技术研究进展

单克隆抗体具有特异性强、表达较稳定等优势,而鸡IgY抗体因其种属距离等特点而具备一系列特殊优势,诸如交叉反应小、产生IgY的鸡免疫系统对哺乳动物保守的生物分子反应明显等,如能将这两种抗体的优势结合起来,开发单克隆卵黄抗体则有望大大拓展抗体的研究模式和应用领域.针对这一新兴领域,从单克隆卵黄抗体的理论背景、研发与技术现状和可能的应用前景三个角度综述了国外的研究现状.     

Ezrin多克隆抗体制作及应用

构建Ezrin原核重组表达载体pET-28a(+)-ezrin,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导获得Ezrin蛋白,将经镍柱亲和层析纯化后的蛋白分别免疫新西兰大耳兔和昆明小鼠(KM),获得抗血清,采用ELISA和Western blotting,免疫荧光测定其效价和特异性。ELISA对抗血清进行效价测定表明抗血清可与抗原发生特异性免疫反应;通过Western blotting对抗血清进行鉴定表明抗血清可以识别几种细胞株内的特异性条带,其相对分子量为82 kD,与预测分子量相符;免疫荧光试验表明抗血清可以识别细胞内的Ezrin蛋白,且定位情况与文献报道相符。最后通过protein G对抗血清进行了纯化。结果表明用该方法制备的Ezrin多克隆抗体有较高的特异性和灵敏度。     

DMSO抑制杂交瘤增殖促进抗体的分泌

利用DMSO促进杂交瘤细胞分泌单克隆抗体,并对其作用机制进行了研究。结果表明在杂交瘤细胞对数生长后期添加0.6%浓度的DMSO与对照相比可提高抗体的产量2倍;流式细胞仪检测细胞周期表明此时837%的细胞处于G1期;免疫印记结果显示在有DMSO作用下杂交瘤细胞P27 蛋白表达显著升高。因此,DMSO 可通过促进P27蛋白的表达,抑制杂交瘤细胞的增殖,从而提高杂交瘤细胞分泌抗体的能力。对DMSO进一步在高密度大规模培养杂交瘤细胞中的应用具有重要意义。     

工程原核生物和酵母菌中生产单克隆抗体和抗体片段研究进展 *

抗体药物和抗体片段药物在药物市场占据了重要的地位,主要通过哺乳动物细胞系统进行生产,操作复杂并且成本高。为了能够克服哺乳动物细胞系统生产抗体药物的弊端,越来越多的抗体及抗体片段在原核细胞及酵母菌中生产,但是产率往往不高并且没有糖基化。从基因转录和翻译的优化、分子伴侣的共表达和抑制蛋白水解降解等方面概述了在原核生物表达系统及酵母菌中提高单克隆抗体和抗体片段产量的研究进展,为未来利用原核生物和酵母菌实现工业化生产单克隆抗体及抗体片段奠定基础。     

人源化抗体制备及其应用研究进展

伴随着一系列重大生物技术(如PCR技术、抗体库技术、转基因动物技术等)的发展,抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。人源化抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面已经显示出独特的优势和良好的应用前景。介绍了人源化抗体的构建及其表达系统,并对其临床应用进行了展望。