EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞中调控核转录因子κB活性研究

为了探讨ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１（ＬＭＰ１）的致瘤机制,对鼻咽癌细胞中ＬＭＰ１通过核转录因子ｋＢ（ＮＦｋＢ）介导的信号传导途径在鼻咽癌变中的意义进行了研究。利用ＬＭＰ１受四环素衍生物强力霉素诱导表达的鼻咽癌细胞Ｔｅｔ－ｏｎ－ＬＭＰ１ＨＮＥ２,通过ＮＦｋＢ报道基因分析法、凝胶迁移率分析（ＥＭＳＡ）及细胞集落形成率等方法,结合硫代磷酸反义寡核苷酸阻断技术,证实ＬＭＰ１增强鼻咽癌细胞ＮＦｋＢ的ＤＮＡ结合活性     

热休克因子1活性的调控机制

热休克因子1(HSF1)是调控热休克蛋白(HSPs)表达的核心转录因子,可被热应激、氧化应激、缺氧/血、pH下降等刺激因素激活,与靶基因的热休克元件特异性结合,增强HSPs表达,发挥内源性保护作用.HSF1活性的调控发生在HSF1三聚化、转位入核、结合DNA和调节转录等多个环节,受到分子伴侣蛋白、磷酸化作用、氧化-还原等机制共同调控,其复杂而精确的调控对于应激应答、生长发育等过程有重要意义.     

小鼠异位气管移植模型中核转录因子NF—κB激活MCP-1诱导闭塞性细支气管炎的研究

目的利用同种异体小鼠异位气管移植模型,研究NF—κB是否激活MCP-1基因参与闭塞性细支气管炎（OB）,探讨OB的发病机制。方法将小鼠异位气管移植模型分成同基因组（BALB／C→BALB／C）和异基因组（BALB／C→C57BL／6）,在术后7、14、21d观察气管移植物是否发生OB;免疫组化染色检测气管移植物MCP-1蛋白表达;EMSA测定各组气管移植物NF—κB的转录活性改变;RT—PCR检测MCP-1的mRNA水平;ELASA检测外周血MCP-1蛋白水平。结果异基因移植实验组气管移植物管腔闭塞率在术后7d仅（6±3）％,14d为（28±）8％,21d达到（74±12）％,而同基因移植对照组管腔闭塞率在术后7～21d均小于3％;与对照组比较,实验组气管移植物NF—κB的转录活性在术后7、14、21d均明显升高;气管移植物MCP-1mRNA及血清中MCP-1蛋白水平术后7、14d升高,术后21d与对照组比较无显著差异。结论同种异体小鼠异位气管移植中,NF—κB转录活性增强,在移植后早期激活其下游靶基因MCP-1募集单核细胞和淋巴细胞攻击移植物,促进闭塞性细支气管炎的发生发展。     

热休克转录因子1对高迁移率族蛋白B1的转录调控作用及机制

目的：探讨烧伤血清诱导下热休克转录因子1（HSF1）对高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的转录调控作用及其机制.方法：构建热休克转录因子1真核表达载体pcDNA3.1-HSF1,HMGB1野生型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-Y,HMGB1突变型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-T.pcDNA3.1-HSF1转染巨噬细胞RAW264.7,烧伤血清诱导后,半定量RT-PCR检测HMGB1 mRNA的表达.pcDNA3.1-HSF1,HMGB1启动子荧光素酶报告基因共转染RAW264.7,烧伤血清诱导后,检测并比较pGL3-HMGB1-Y和 pGL3-HMGB1-T的相对萤光素酶活性.结果：烧伤血清诱导下,HSF1可以下调RAW264.7 HMGB1mRNA的表达.pGL3-HMGB1-T的相对荧光素酶值较pGL3-HMGB1-Y明显下降,P＜0.01,差异有显著统计学意义.结论：烧伤血清诱导下,HSF1可能通过与HMGB1启动子区HSE的结合下调小鼠巨噬细胞RAW264.7 HMGB1mRNA的表达.     

EWS蛋白质抑制核因子κB的转录活性

目的:研究EWS蛋白质是否参与核因子κB(NF-κB)信号通路,以及EWS蛋白质对NF-κB转录活性的影响。方法:在真核细胞中表达Flag-EWS,利用Western印迹检测其表达;通过双萤光素酶光报告系统,研究EWS蛋白质对NF-κB转录活性的影响及其发挥作用的分子水平。结果:Western印迹检测到相对分子质量为95×103的Flag-EWS能够在真核细胞中正确表达,过表达EWS蛋白质能够抑制TNFα、IL-1β及poly(I:C)激活的NF-κB转录活性;EWS蛋白质能够抑制由过表达HA-TRAF2或HA-p65激活的NF-κB转录活性,其抑制NF-κB转录活性发生在p65转录因子水平。结论:过表达EWS能够抑制多种刺激激活的NF-κB转录活性,这种抑制作用发生在p65转录因子水平。     

人热休克因子1对抗增殖蛋白基因启动子转录调控的研究

目的：研究人热休克因子1（hHSF1）对抗增殖蛋白（pmhibitin）动子转录活性的影响。方法：采用PCR方法扩增hHSF1全长编码序列,构建peDNA3．1（＋）-hHSFl真核表达载体,将peDNA3．1（＋）-hHSF1和人prohibitin基因启动子表达载体pGL3-prohibitin共同转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测双荧光索酶活性,分析hHSF1对抗增殖蛋白基因启动子的转录调控作用。结果：成功构建peDNA3．1（＋）-hHSF1真核表达载体,荧光素酶活性测定发现hHSF1明显上调pGL3-prohibitin转录。结论：hHSF1对prohibitin具有转录调控作用。     

Epstein-Barr病毒潜伏蛋白1通过核转录因子κB诱导鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性

利用已建立的原代人胚鼻咽上皮细胞和Tet-on-LMP1系统等良好的实验模型,采用荧光酶报道基因分析法和端粒酶TRAP-ELISA技术,分别检测EB病毒潜伏蛋白1(LMP1)诱导的核转录因子κB(NFκB)活性和端粒酶活性,从LMP1介导NFκB信号传导途径角度,探讨LMP1诱导端粒酶表达的分子机制.结果表明,LMP1可诱导鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性,将LMP1羧基端胞浆区突变后,可同时下调NFκB活性和端粒酶活性.在Doxycycline诱导LMP1表达状态下,NFκB反式激活活性增强,同时端粒酶活性升高;进一步应用硫代磷酸化修饰的反义NFκB p65寡脱氧核苷酸和IκBα的显性负性突变体分别阻断NFκB活性,可降低由LMP1诱导的端粒酶活性.因此,NFκB作为LMP1信号传导途径上的枢纽,可能介导了LMP1对端粒酶的表达调控.     

氧化还原作用对热休克转录因子1结构和功能的调控

为了评价半胱氨酸巯基氧化还原介导剂对人热休克转录因子 1(hHSF1)的氧化还原、结构和功能的作用 ,在体外用浓度为 0 .3～ 0 .5mmol/L的巯基氧化型介导剂二酰胺 (diamideDM )处理hHSF1;在体内用浓度为0 .1mmol/L的γ 谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁硫堇处理HeLa细胞 ,都可形成一种致密的、分子内二硫键交联的氧化型hHSF1(ox hHSF1) ,使hHSF1三体形成和活化被阻断。二酰胺的这种作用呈剂量依赖 ;在电泳前加入浓度为 0 .4～ 0 .5mmol/L的巯基还原剂二硫苏糖醇 (DTT)到DM处理过的标本中再培育 ,能迅速和完全逆转这种作用。HSF1单体和三体功能域α 螺旋卷曲结构的计算机模型显示 ,在hHSF1单体N端和C端的疏水重复区中 ,半胱氨酸C1(第 15 3位氨基酸 )与半胱氨酸C4(第 373位氨基酸 )、C5(第 378位氨基酸 )非常接近 ,在合适的氧化作用下很容易形成二硫键 ,使HSF1单体形式较为稳定 ,不能形成三体并活化。结果表明 ,hHSF1的结构和功能与半胱氨酸上巯基的氧化还原化学性能相关 ;氧化作用和转录因子分子内巯基二硫键交联形成ox HSF1单体 ,可能是衰老细胞热体克转录反应呈渐减性的原因。     

热休克转录因子1与机体耐热性的相关研究

热休克转录因子1(HSF1)能够启动各种热休克蛋白基因的诱导表达,这对防止机体免受热应激损伤具有重要的意义。从HSF1的结构、功能及活化过程等几个方面阐述了HSF1的生理特征及其与机体耐热性能之间的关系。     

核呼吸因子1调控NF-κB介导LPS诱导的小鼠急性肺损伤

本文旨在研究核呼吸因子1 (nuclear respiratory factor 1, NRF1)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的肺上皮细胞炎症应答中关键分子核因子-κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)的影响,以阐明NRF1对肺上皮细胞炎性应答的调控作用及机制。在体内水平上,雄性BALB/c小鼠经呼吸道转染NRF1小干扰RNA,LPS (4 mg/kg)或生理盐水经呼吸道雾化给药,48 h后取肺组织。采用免疫印迹(Western blot, WB)及real-time PCR法检测肺组织NRF1、NF-κB p65及其靶基因表达变化,免疫荧光染色法检测NRF1及NF-κB p65核转位情况。体外培养L132肺上皮细胞,转染NRF1小干扰RNA,或给予BAY 11-7082 (5μmol/L)处理24 h后,给予1 mg/L LPS刺激6 h,用real-time PCR法检测NRF1、NF-κB p65及其靶基因表达变化。采用染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, Ch...     

热休克转录因子1的抗炎症作用

热休克转录因子1(heat shock factor 1, HSF1)是调节细胞保护性应激蛋白--热休克蛋白表达的主要转录因子,可被热应激、氧化应激等多种理化因素激活.近年研究表明,HSF1具有抗炎症作用:HSF1可抑制TNFα、IL-1β、M-CSF等致炎因子表达,促进IL-10等抗炎因子表达,并降低NF-κB、AP-1等致炎转录因子的活性.HSF1上调热休克蛋白和抑制炎症的双重活性,提示其很可能是联系应激反应和炎症反应的重要因子.     

衰老细胞中热休克转录因子1的异常调节和定位

为评估人热休克转录因子1（HSF1）在衰老细胞中呈现年龄依赖功能失调机制, 通过凝胶电泳迁移率改变实验(EMSA)和RNA酶保护实验等了解低总体倍增水平（PDLs）的年轻和高PDLs的衰老IMR90双倍体人肺纤维母细胞的HSF1 DNA 结合活性、HSF1蛋白质及其编码转录子mRNA水平和亚细胞分布.使用H2O2诱导年轻IMR90细胞成为“应激诱导早熟性老化(SIPS)” 细胞,并与复制性衰老细胞比较HSF1 DNA 结合活性、HSF1亚细胞分布和细胞内过氧化物含量.在不同年龄的IMR90细胞中,无论体内或体外,HSF1激活能力与细胞年龄呈反相关,但细胞内HSF1蛋白质与其mRNA水平并无改变.HSF1的亚细胞定位分析显示,HSF1主要存在于年轻细胞胞质中,热刺激促使三体形成和核转移;而在衰老细胞中,37℃时HSF1大部分存在于细胞核内,热刺激后形成三体,与DNA结合能力明显比年轻细胞弱;用H2O2诱导的应激成熟前老化细胞内,HSF1功能和亚细胞分布都与复制性衰老细胞相似.结果显示,细胞年龄与HSF1的激活和定位相关,而与HSF1含量无关,这些变化可能是通过氧化修饰所致.     

利用双萤光素酶报告系统研究FoxM1转录活性调控

目的:构建细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)启动子萤光素酶报告系统,用于转录因子FoxM1转录活性调控研究。方法:利用瞬时转染、实时荧光定量PCR及Western印迹,验证人胚肾HEK293细胞中FoxM1对Cyclin B1 mRNA的转录及蛋白表达的调节作用;利用PCR技术从人宫颈癌HeLa细胞基因组中钓取人源Cyclin B1的启动子序列,克隆至pGL3-Basic Vector中,构建含有Cyclin B1启动子的萤火虫萤光素酶报告质粒pGL3-Cyclin B1;通过瞬时转染、Western印迹及萤火虫/海肾萤光素酶双报告系统,研究c-Abl酪氨酸激酶对FoxM1转录活性的调控作用。结果:构建了Cyclin B1萤火虫萤光素酶报告系统,该报告系统可用于FoxM1转录活性研究;c-Abl酪氨酸激酶能够显著抑制FoxM1靶向Cyclin B1启动子的转录活性,且抑制作用依赖c-Abl的激酶活性。结论:pGL3-Cyclin B1萤光素酶报告系统可用于研究c-Abl酪氨酸激酶介导的FoxM1转录活性调节。     

热休克因子1基因剔除对小鼠生长繁殖的影响

目的观察HSF1基因剔除对小鼠生长、繁殖的影响。方法用HSF1基因剔除纯合子、杂合子和野生型小鼠建立交配对,HSF1基因正常繁殖组（简称HSF1正常组）30对、HSF1基因缺陷繁殖组（简称HSF1缺陷组）72对。观察母鼠产仔数、生产胎数、每胎产仔数、成年鼠体重。结果HSF1缺陷组母鼠平均产仔数（13.00±11.50）较少,与HSF1正常组（26.46±16.02）比较差异有显著性（P〈0.01）。HSF1缺陷组母鼠每胎产仔数（4.65±2.33）亦较少,与HSF1正常组（7.56±3.08）比较差异有显著性（P〈0.01）。HSF1缺陷组母鼠平均生产胎数（2.79±2.64）与HSF1正常组（3.50±2.19）比较差异无显著性（P〉0.05）。HSF1缺陷组成年小鼠平均体重（20.53±4.62）较轻,与HSF1正常组（23.06±3.39）比较差异有显著性（P〈0.01）。结论HSF1基因剔除小鼠被广泛应用于研究HSF1功能,但HSF1基因剔除对生殖、生长和健康状态的影响不容忽视。     

外源性硫化氢对大鼠内毒素性肺损伤的影响及机制研究

目的：应用H2S供体硫氢化钠（NaHS）,观察外源性H2S对中性粒细胞（PMN）在脂多糖（LPS）刺激大鼠肺内聚集的影响及其机制。方法：采用尾静脉注射致Sprague-Dawley（SD）大鼠内毒素急性肺损伤（ALI）模型,将大鼠随机分为4组（n=8～12）。对照组：由尾静脉注射无菌生理盐水（0.5ml/kg）;LPS组：由尾静脉注射LPS（1mg/kg）;LPS＋NaHS组：注射LPS前10min腹腔注射NaHS（28μmol/kg）;NaHS组：腹腔注射NaHS（28μmol/kg）。6h后光镜下观察各组大鼠肺组织学变化并计数肺泡间隔中PMN数目（number/HP）;脱氧核苷酸末端转移酶介导的原位末端标记技术（TUNEL）测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中PMN凋亡百分率及应用Western blot检测肺组织细胞间黏附分子（ICAM）-1和核转录因子（NF）-κB表达的变化。结果：注射LPS后动物肺组织出现出血、水肿及PMN聚集等病理征象。LPS组大鼠肺组织中PMN数目较对照组显著增加,PMN凋亡百分率下降,ICAM-1、NF-κB表达显著增高;应用NaHS后每高倍镜PMN数目显著减少,PMN凋亡百分率明显增高,ICAM-1、NF-κB表达显著降低,肺组织损伤减轻。单独应用NaHS组大鼠上述各项指标与对照组大鼠相比无显著差异。结论：NaHS可减少PMN在肺内聚集,其机制与其抑制NF-κB通路,从而下调ICAM-1表达、促进PMN凋亡有关。     

人热休克蛋白转录因子1 DNA结合结构域的表达、纯化和晶体生长

目的:获得大量热休克转录因子1(HSF1)DNA结合结构域(DBD)蛋白,用于晶体生长的三维结构解析。方法:将DBD基因片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中并获得高效表达,经过Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析、ResourceQ纯化后,蛋白纯度达到95%以上。结果:圆二色谱仪分析蛋白质的二级结构结果显示α螺旋占33%,β折叠占15%;采用悬滴气相扩散法得到了针状DBD晶体。结论:纯化的蛋白质与同源性达68%的Kluyveromyceslactis的DBD有相似的空间构象。获得的蛋白质晶体为进一步的三维结构解析奠定了基础。     

正显性热休克因子1突变体抑制6-OHDA诱导细胞死亡的研究

热休克因子1是真核细胞应激反应时热休克蛋白表达的主要转录调控因子。它在非应激条件下被抑制性复合体抑制以非活化形式存在,只有在受到应激时才会暂时活化。通过基因突变得到的正显性突变体在不需要外界环境刺激的条件下就能激活细胞内源性热休克蛋白的表达。环境神经毒素是引起帕金森病的一个重要因素,它们能够氧化损伤多巴胺能神经元,最终引起细胞死亡。Western blot和双荧光素酶检测证明,在SH-SY5Y细胞中转染正显性热休克因子1突变体能够明显上调HSP70的表达。并且通过检测细胞培养基中的乳酸脱氢酶的含量证明正显性热休克因子1突变体能够显著抑制神经毒素6-羟基多巴胺诱导的细胞死亡。这些结果表明,正显性热休克因子1突变体在帕金森病的防治方面可能具有潜在的应用前景。