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本文报道以人Epstein-Barr病毒的潜伏膜蛋白基因BNLF-1作为目标基因,插入至逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)-LMP及其反义载体pZipNeoSV(x)-anti-LMP,通过质粒DNA的电转染和G418培养基筛选,然后对10个抗性克隆进行基因整合分析,获得6个含MLV-LTR/BNLF-1融合基因的阳性克隆,采用Northern杂交及Western印迹证明,在克隆细胞中表达了2.6kb的mRNA片段及相应的蛋白质分子,这是由BNLF-1基因的EDL1启动子表达的产物。 相似文献
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本文通过聚合酶链式反应(PCR),从整合有人T细胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-I)的MT-2细胞株中,扩增出HTLV-I外膜蛋白(env)的全基因(1.45kb),并成功地克隆入pUC19载体,构建成env基因克隆env/pUC19.利用原核高效表达载体pGEX-2T,在大肠杆菌中有效地表达了与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的env羧基末端抗原的重组蛋白,融合基因的转录由tac启动子调控。SDS-PAGE结果表明,有一约52kD的目的蛋白带,表达量占菌体总蛋白的10%;WesterNblott及ELISA结果显示,表达产物能与HTLV-I多抗血清结合。本研究为研制HTLV-I的诊断试剂及进一步了解env的免疫学和生物学性质打下了基础。 相似文献
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人免疫缺陷病毒1型Rev单链抗体细胞内免疫抗病毒基因治疗研究 总被引:2,自引:0,他引:2
应用抗HIV-1Rev单链抗体细胞内免疫方法,研究在人T细胞和周围血淋巴单核细胞内抗病毒复制的效果,探讨细胞内免疫抗HIV-1基因治疗的可行性。克隆抗HIV-1Rev单链抗抗体(sFv)基因,以逆转录病毒为基因载体,将名装后的含靶基因的逆转录病毒转导至人CD4阳性T-细胞株CEM和SupT1,以及HIV-1阴性自愿者的周围血淋巴单核细胞(PBMC),再分别用不同剂量(MOI)的HIV-1病毒株PN 相似文献
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应用染色体原位杂交、PCR扩增、克隆及核苷酸序列分析等方法,分析了CNE1和CNE3细胞株中的潜伏感染膜蛋白(LMP1)基因。CNE1是来自我国东北的高分化鼻咽癌细胞株,CNE3是来自广西的低分化鼻咽癌细胞株。染色体原位杂交结果表明,CNE1细胞中LMP1基因存在于细胞核内,整合在第一号染色体上,CNE3中LMP1基因则随机存在于细胞核内及多条染色体上。用PCR方法分别从CNE1及CNE3中扩增得到了LMP1基因片段(外显子3),核苷酸序列分析证明,来自CNE1的LMP1与来自B95-8细胞的LMP1核苷酸序列同源性极高,达99.5%,而CNE3的LMP1基因与B95-8的LMP1基因同源性为93%。 相似文献
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EB病毒(EBV)是一种与地区性伯基特氏淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金氏病等多种人体肿瘤有关的疱疹病毒.已往的研究表明,潜伏膜蛋白(LMP)基因是EBV最可能的致瘤基因.为制备LMP基因转基因小鼠,探讨LMP的体内致瘤作用,首先构建了含鼠金属硫蛋白-1(MT-1)基因调控区和LMP基因编码区的pBR322-MT-LMP质粒,并用电击法将该质粒与pKJ1-Neo质粒共转染人胃癌细胞株MGC,对MT-LMP基因在转染细胞中的整合、转录情况及重金属镉和镍对该融合基因的转录调控进行了研究.结果表明:(1)两质粒共转染效率为86.7%;(2)PCR和Southern杂交分析显示,完整的MT-LMP基因已整合入转染的MGC细胞基因组,且在不同的转染细胞克隆中,MT-LMP基因整合的方式及拷贝数不同,拷贝数从1到19不等;(3)RT-PCR和Northern杂交分析证实,MT-LMP基因不仅在转染的MGC中能够转录,而且在10μmol/L镉诱导下,MT-LMP基因转录增强,平均增高约1.4倍.结果说明,在MT-1基因调控区指导下,LMP基因不但有mRNA水平的表达,而且其表达受重金属镉的调控,上述结果为制备MT-LMP转基因小鼠 相似文献
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鼻咽癌中感染的EBV以潜伏态存在,只有少数基因得到表达。我们从分子生物学水平研究其潜伏机制。已知BZLFl基因和BamHIEZ片段内部分基因对EBV的复制激活起关键作用。我们用体外基因扩增(PCR)法扩增BZLFl基因外显子-1序列,并用序列分析法研究了该基因结构特点。此外,检测了BamHIEZ片段内缺失,结果发现21例鼻咽癌(NPC)组织中,ll例有BamHIEZ片段内缺失,长2.99kb,与潜伏态存在的RajiEBV类似。提示鼻咽癌小的EBV以潜伏态存在,与NPC发病有关。 相似文献
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鼻咽癌中感染的EBV以潜伏态存在,只有少数基因得到表达。我们从分子生物学水平研究其潜伏机制。已知RZLF1基因和BamHIEZ片段内部分基因对EBV的复制激活起关键作用。我们用体外基因扩增(PCR)法扩增BZLF1基因外显子-1序列,并用序列分析法研究了该基因结构特点。此外,检测了BamHIEZ片段内的基因缺失,结果发现21例鼻咽癌(NPC)组织中,11例有BamHIEZ片段内缺失,长达2.99k 相似文献
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以癌胚抗原(CEA)阳性性人结直肠癌细胞株LoVo及CEA阴性细胞株HeLa为模型,进行了结直肠癌专一性自杀基因治疗研究。在CAT分析验证了cea启动了的细胞专一性的基础上,构建了在cea基因启动子控制下表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(CD)的真核表达质粒pCEACD。转染pCEACD的LoVo细胞对原药5-氟胞嘧啶(5FC)的敏感性提高了750倍,并存在着明显的旁杀伤效应;同样条件下,HeLa细胞 相似文献
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DNaseⅠ超敏感位点的研究能够发现潜在的调控基因转录活化的位点,比较正常人外周血有核细胞,淋巴瘤细胞株P3HR1和人鼻咽癌低分化磷癌细胞株HOnE1和HNE2中Ha-ras-1瘤基因的DNaseⅠ超敏感位点发现,只有HONE1和HNE2细胞基因组中存在一个DNaseⅠ超敏感位点,位于第一个外显子上游0.37kb处,上述结果提示正常白细胞和P3HR1细胞中Ha-ras-1基因处于失活状态,而在鼻咽癌细胞基因组中则处于活化状态,它的活化可能与0.37kb处的DNA序列有密切的关系。 相似文献
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Tx基因与Igk基因的同源性研究及其在不同细胞株的表达 总被引:10,自引:1,他引:9
本文对以前报道的Tx基因2.8kb片段的核苷酸序列与人免疫球蛋白kappa链C区基因的核苷酸序列及其编码产物的氨基酸序列进行了同源性比较。结果表明,Tx基因与kappa链C区基因的同源性高达99.5%以上,编码区的同源性高达100%。从而提示Tx基因与kappa链C区基因可能是同一种基因。限制性内切酶图谱及Southern印迹杂交分析,也进一步支持这一观点。本文还报道了kappa链C区基因在不同细 相似文献
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鼻咽癌恶性转化基因Tx中3.0kb片段序列分析 总被引:3,自引:0,他引:3
从中国人鼻咽癌细胞株 CNE2中克隆分离出的恶性转化基因 Tx,其基因长度为 1 6kb.在对其中 2 .8kb片段测序的基础上 ,对其中 Xho /Eco R 长度约 3.0 kb的片段 ( Tx3.0 )进一步进行了测序 ,并利用生物信息学技术分析认为 ,Tx3.0与人类免疫球蛋白 kappa( Igκ)轻链基因高度同源 ,并直接映射于 J区 .Tx3.0中除有编码免疫球蛋白 kappa链的 J2、J3、J4及 J5基因片段外 ,在各个片段间不仅有 TATA box、CAAT box和 Poly A等经典的调控序列 ,还有 NF- IL6的反应元件、某些转录因子的识别序列、以及核基质结合序列等 .据此以及 2 .8kb序列的分析结果 ,对 Tx3.0下游 1 .0 kb片段序列进行了预测 .对 Tx3.0基因片段的研究为进一步研究 Tx基因在鼻咽癌发病中的作用 ,提供了重要信息 . 相似文献
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本文运用定点克隆法并结合鸟枪法,对人类鼻咽癌细胞抹CNE2转化基因Tx中一个与转化作用有关的Eco RI片段,进行了核苷酸序列分析。此种克隆方法的运用,大大减少了DNA模板的数量,并加快了测序的进展。将序列分析结果输入美国NCI的CRAY-2型超级电子计算机作进一步分析,以寻找基因库中的同源序列,酶切位点,开放阅读框架(ORF)。在人类DNA基因数据库中没有找到同源序列,从而证实Tx基因是一种新的人类转化基因。计算机的分析还得出了一系列有价值的结论,为进一步深入探讨这个基因在人类鼻咽癌发病学中的作用,提供了重要的资料。这是首次报道的Tx基因核苷酸序列分析结果。 相似文献
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Variable expression of latent membrane protein in nasopharyngeal carcinoma can be related to methylation status of the Epstein-Barr virus BNLF-1 5''-flanking region. 总被引:7,自引:5,他引:2
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L F Hu J Minarovits S L Cao B Contreras-Salazar L Rymo K Falk G Klein I Ernberg 《Journal of virology》1991,65(3):1558-1567
Seven virus-coded proteins, the nuclear proteins EBNA-1 to EBNA-6 and the latent membrane protein (LMP), are regularly expressed in Epstein-Barr virus (EBV)-transformed lymphoblastoid cell lines. In nasopharyngeal carcinoma (NPC), only EBNA-1 is regularly expressed; LMP is detected in about 65% of the tumors. In Burkitt's lymphoma tumors only EBNA-1 is expressed. We have recently shown that the methylation patterns of the EBV genome varied between these cell types. In virally transformed lymphoblastoid cell lines of normal origin, the EBV DNA is completely unmethylated. In contrast, in the Burkitt's lymphoma-derived cell line Rael and in a nude mouse-passaged NPC tumor, C15, there was an extensive methylation of CpG pairs. The methylation extended into the coding regions of the two expressed genes, EBNA-1 (in both tumor types) and LMP (in C15). Two presumptive control regions were exempted from this overall methylation: the oriP that contains both an origin of DNA replication and an EBNA-1-dependent enhancer and the 5'-flanking region of the BNLF-1 open reading frame that codes for LMP. The latter was only exempted in the LMP expressing NPC. We have now investigated the relation between expression of LMP and methylation of DNA in the 5'-flanking 1 kb region of BNLF-1, coding for LMP. LMP was methylated in 3 of 12 NPC biopsies that did not express LMP but was partially or totally unmethylated in the remaining 9 that expressed the protein. The three BNLF-1 exons were highly methylated in all the tumors. The oriP region was unmethylated in all the tumors, as in the previously studied Rael cell line and nude mouse-passaged NPC. Also, the BamHI W enhancer region involved in the expression of EBNA nuclear proteins was methylated. None of the biopsies expressed EBNA-2. Our data show that the EBV genomes are highly methylated in NPC tumors. The strong reverse correlation between the methylation of the putative control region of the LMP gene and the expression of LMP suggests that methylation has a role in the regulation of this gene. 相似文献
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Whether certain Epstein-Barr virus (EBV) strains are associated with pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma (NPC) is still an unresolved question. In the present study, EBV genome contained in a primary NPC tumor biopsy was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR), and sequenced using next-generation (Illumina) and conventional dideoxy-DNA sequencing. The EBV genome, designated HKNPC1 (Genbank accession number JQ009376) is a type 1 EBV of approximately 171.5 kb. The virus appears to be a uniform strain in line with accepted monoclonal nature of EBV in NPC but is heterogeneous at 172 nucleotide positions. Phylogenetic analysis with the four published EBV strains, B95-8, AG876, GD1, and GD2, indicated HKNPC1 was more closely related to the Chinese NPC patient-derived strains, GD1 and GD2. HKNPC1 contains 1,589 single nucleotide variations (SNVs) and 132 insertions or deletions (indels) in comparison to the reference EBV sequence (accession number NC007605). When compared to AG876, a strain derived from Ghanaian Burkitt's lymphoma, we found 322 SNVs, of which 76 were non-synonymous SNVs and were shared amongst the Chinese GD1, GD2 and HKNPC1 isolates. We observed 88 non-synonymous SNVs shared only by HKNPC1 and GD2, the only other NPC tumor-derived strain reported thus far. Non-synonymous SNVs were mainly found in the latent, tegument and glycoprotein genes. The same point mutations were found in glycoprotein (BLLF1 and BALF4) genes of GD1, GD2 and HKNPC1 strains and might affect cell type specific binding. Variations in LMP1 and EBNA3B epitopes and mutations in Cp (11404 C>T) and Qp (50134 G>C) found in GD1, GD2 and HKNPC1 could potentially affect CD8(+) T cell recognition and latent gene expression pattern in NPC, respectively. In conclusion, we showed that whole genome sequencing of EBV in NPC may facilitate discovery of previously unknown variations of pathogenic significance. 相似文献
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EB病毒LMP-1上调鼻咽癌细胞系AP-1的活性 总被引:13,自引:2,他引:13
为了探讨 EB病毒潜伏膜蛋白 1 ( LMP- 1 )通过信号传导途径介导的致瘤分子机制 ,由此首先构建了 AP- 1报告基因 ,用佛波酯诱导确定了其报道 AP- 1的功能 ;通过建立荧光素酶双报道系统 ,研究了 LMP- 1表达对 AP- 1和 NFκB活性的影响 .研究发现 :在 LMP- 1阴性鼻咽癌 ( NPC)细胞系 ,导入 LMP- 1表达质粒后 ,AP- 1和 NFκB的活性均升高 4~ 5倍 ;而在 LMP- 1阳性 NPC细胞系中 ,当导入 LMP- 1反义表达质粒 ,AP- 1和 NFκB的活性则受抑制 ,活性下调 3~ 4倍 .结果表明 ,LMP- 1能上调 NPC细胞系 AP- 1的活性 ,同时再次证实了 LMP- 1能活化 NFκB. 相似文献
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鼻咽癌恶性转化基因Tx核苷酸序列分析 总被引:5,自引:0,他引:5
从人类鼻咽癌细胞系CNE2基因组DNA文库中克隆一个恶性转化基因Tx转染小鼠JB6 + 细胞 ,使细胞恶性转化 ,宿主细胞具有停泊非依赖生长的特性 .已经报道的Tx中一个 3 0kb片段(Tx3 0 )的序列分析结果表明 ,Tx包含人类免疫球蛋白κ轻链完整的J区 .进一步对Tx全长进行亚克隆和测序 ,并采用生物信息学方法进行分析表明 ,Tx包含人类Igκ完整的J区、C区基因片段、还有 5个重组信号序列 ,1个核基质结合序列和 1个N segment的插入 .Tx与正常人IgκJ、C区比较只是在某些位点存在碱基的缺失、插入或置换 ,二者同源性高达 98% ,其电子定位于 2p11 2 ,这与人Igκ的染色体定位是一致的 .可以认为 ,Tx是一个缺乏V区的异常的人类免疫球蛋白kappa轻链基因 相似文献
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鼻咽癌差异表达基因PROL4特性分析 总被引:1,自引:3,他引:1
在正常成人鼻咽与鼻咽癌活检组织之间进行抑制性消减杂交和微阵列(microarray)杂交,获得了鼻咽癌差异表达基因PROL4的全长cDNA序列,其GenBank登录号为:AF530472.该基因包含567个核苷酸,其编码产物是由134个氨基酸组成的富含脯氨酸蛋白.采用RT-PCR证实了PROL4基因在鼻咽癌细胞株HNE1和鼻咽癌活检组织中表达下调或缺失(42/48).12种组织RNA印迹显示:PROL4基因在人骨骼肌、胸腺和肺组织中表达,其转录本大小约为0.6 kb,与所克隆的PROL4基因的cDNA大小一致.进而通过肿瘤表达谱阵列(cancer profiling array)杂交检测了其在乳腺癌、子宫癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、子宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、小肠癌组织及其配对的正常组织的表达状况. 相似文献