增强原位杂交探针敏感性的研究

原位杂交(ISHH)属于固相分子杂交范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法.     

植物小RNA荧光原位杂交实验方法

小RNA是对植物生长发育十分重要的一类小分子核苷酸,在多种生命过程以及胁迫响应中发挥重要调控作用。对小RNA的定位研究有助于揭示它们的功能,而小RNA荧光原位杂交(sRNA-FISH)是一种通过荧光检测技术对生物体内小RNA进行定性或半定量分析的技术,目前该技术已经在动物体内被广泛应用,而在植物体内的应用还比较少。该文...     

地高辛标记Ucp2基因RNA探针的制备和应用

目的:制备用于检测小鼠胚胎早期Ucp2基因表达的地高辛标记的特异性RNA探针。方法:提取小鼠胚胎脑组织总RNA,设计引物,通过RT-PCR方法获取Ucp2基因片段,将其克隆到pGEM-T载体。分别利用Sp6、T7和Ucp2特异性引物,PCR扩增获得转录模板,通过Sp6及T7 RNA聚合酶,获得地高辛标记的正义、反义Ucp2 RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后,通过全胚胎原位杂交分析制备探针的特异性和杂交效果。结果:成功获得Ucp2基因正义、反义探针,反义探针能高效灵敏检测到Ucp2基因在小鼠胚胎Ed9.5、Ed10.5神经系统呈现高表达,而正义探针未能检测到表达信号。结论:成功制备了特异高效的地高辛标记Ucp2 RNA原位杂交探针,为进一步研究Ucp2基因在小鼠胚胎组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础。     

RNA原位杂交技术的一些应用技巧

目的:检测基因在动物组织或细胞中的时空表达模式。方法:转录反义RNA探针;利用RNA原位杂交技术检测人和小鼠牙原基中若干基因的表达。结果与结论:通过优化条件,转录出完整的反义RNA探针,并成功地利用RNA原位杂交技术在组织中检测到基因的表达;分析了一些在RNA原位杂交的过程中可能碰到的问题及其解决方法。     

间期细胞原位杂交进行产前诊断的研究 I. 用Y探针探讨该方法可行性

本文探讨用原位杂交方法产前诊断染色体数目异常先天性疾病的可能性。本实验用Y^3.4探针与正常男性和女性的外周血淋巴细胞以及冲洗早孕妇子宫颈及子宫得到的细胞进行原位杂交。经放射自显影后结果表明，在男性细胞中有杂交点的间期细胞数目显著高于在女性中的数目，p<0.005。从而证实了该方法可用于染色体数目异常如21-三体综合症的产前诊断。     

生物素标记HBV RNA探针的制备及应用

本文首次采用ＳＰ６５特殊质粒与人类的乙型肝炎病毒ＤＮＡ重组,制备了Ｂｉｏ－ＨＢＶ ＲＮＡ探针,能特异地与ＨＢＶ ＤＮＡ杂交,将该探针与缺口转移方法标记的Ｂｉｏ－ＨＢＶ ＤＮＡ探针进行了比较,结果显示出Ｂｉｏ－ＨＢＶ ＲＮＡ探针比Ｂｉｏ－ＨＢＶ ＤＮＡ探针的敏感性提高１０倍,并分别应用两种探针同时检测７０例乙肝病人血清中ＨＢＶ ＤＮＡ,阳性率各为３１．４２％、２８．５７％（Ｐ＞０．２５）。对Ｂｉｏ－     

间期细胞原位杂交进行产前诊断的研究 Ⅰ.用Y~(3.4)探针探讨该方法可行性

本文探讨用原位杂交方法产前诊断染色体数目异常先天性疾病的可能性。本实验用Y~(3.4)探针与正常男性和女性的外周血淋巴细胞以及冲洗早孕妇子宫颈及子宫得到的细胞进行原位杂交。经放射自显影后结果表明,在男性细胞中有杂交点的间期细胞数目显著高于在女性中的数目,p<0.005。从而证实了该方法可用于染色体数目异常如21-三体综合症的产前诊断。     

应用小鼠整体原位杂交技术检测MDM2在鼠胚发育不同阶段的表达

整体原位杂交(whole-mountinsituhybridization,WMH)已经成为基因表达定位和表达分布模式研究的一种重要手段.该技术能在整体水平上精确地研究胚胎发育过程中基因表达的三维信息,而且为大规模筛选区域及组织特异性候选克隆提供了有利的技术手段.采用体外转录地高辛标记的RNA探针,检测已知基因MDM2在鼠胚胎发育不同阶段的表达模式.     

大鼠颌下腺促性腺激素释放激素及其mRNA的免疫组织化学与原位杂交研究

用免疫组织化学及原位杂交法,研究了促性腺激素释放激素及其ｍＲＮＡ在大鼠颌下腺的分布。结果显示,大鼠颌下腺的浆液性腺泡的上皮细胞,各级导管的上皮细胞及副交感神经节细胞均呈促性腺激素释放激素免疫反应阳性,阳性反应物质分布在胞质,胞核呈阴性反应。颌下腺的浆液性腺泡上皮细胞,各级导管上皮细胞同样被检测到很强的促性腺激素释放激素ｍＲＮＡ杂交信号。以上结果提示,大鼠颌下腺能自身合成促性腺激素释放激素,促性腺激素释放激素对消化功能可能有重要调节作用。     

以地戈辛标记反义RNA为探针的组织原位杂交

原位分子杂交是在液相和固相分子杂交基础上发展起来的,从染色体、细胞或整体水平在原位研究特异核酸的分布、数量、表达形态及其同细胞的分化、生理或病理状态、形态特征演化之间关系的分子生物学技术。随着技术的发展,原位杂交不仅被用来研究特定DNA、RNA的细胞内的分布,而且被用来探索被检mRNA相关基因的表达。可以说,原位杂交技术在分子生物学与形态学研究之间架起了一座桥梁。     

微小RNA在前列腺癌组织中的表达及意义

目的研究5种微小RNA（microRNA）在前列腺癌组织中的表达情况及其临床意义,并探讨它们在前列腺癌诊断中的潜在应用价值。方法应用核酸分子原位杂交（IsH）的方法,结合组织芯片（TMA）技术检测38例良性前列腺增生（BPH）,52例前列腺癌（PCa）及2例正常前列腺组织中5种miRNAs的表达情况。结果（1）miR-96、miR-183、miR-139在PCa中的表达率分别为67．31％（35／52）,71．15％（37／52）,67．31％（3s／52）,分别与它们在BPH中的表达率44．74％（17／38）,47．37％（18／38）,39．47％（15／38）相比,差异有统计学意义（P〈0．05）;miR-145在PCa中的表达率为21．15％（11／52）,较BPH的63．16％（24／38）低（P〈o．01）;miR-let-7d在PCa中的表达率为25．00％（13／52）,较BPH的34．21％（13／38）无显著性差异（P〉0．05）。（2）5种miRNAs的表达与前列腺癌患者的年龄及血清PSA水平均无明显相关性（P〉0．05）;5种miRNAs表达与肿瘤的G1eason评分均相关（P〈0．01）;miR-96、miR-let-7d及miR-139的表达与肿瘤的临床分期有关（P〈0．01）,miR-145、miR-183的表达则与其无明显相关性（P〉0．05）;miR-96的表达与肿瘤累及前列腺的叶数相关（P〈0．01）,而其余四种miRNAs的表达则与其无明显相关性（P〉0．05）。结论miRNAs与前列腺癌的发生有关,并可能作为前列腺癌早期诊断及预后评估的重要生物标记物。     

一种从RNA Blot杂交膜上脱除探针的改进方法

目的：探讨脱除RNA Blot膜上的杂交探针的方法,解决杂交中RNA Blot膜重复使用的问题。方法：经NBT／BCIP化学显色的RNA Blot杂交膜先用二甲基甲酰胺在60℃处理90min,然后用脱探针溶液(50％去离子甲酰胺、50mmol/L Tris—HCl pH7．5、5％SDS)在80℃处理90min,经过处理的膜再次用于下一轮的杂交。结果：用这一改进的方法,可以完全脱除杂交膜上的地高辛标记的cDNA探针,RNA Blot膜可以重复杂交5轮以上,杂交带仍然保持清晰锐利。结论：该改进方法操作简便,能有效地脱除杂交膜上的地高辛标记的cDNA探针。     

地高辛精标记酪氨酸羟化酶RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ,Ｄｉｇ）标记的酶氨酸羟化酶（ＴｙｒｏｓｉｎｅＨｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ,ＴＨ）ＲＮＡ探针,本研究用分子生物学技术重组质粒ＰＧＥＭＴＨＩ,即分别将携带Ｔ７和Ｓｐ６启动子的ＰＧＥＭ－３ｚｆ质粒和携带ＴＨ基因的ＰＫＳＴＨ质粒用限制性内切酶消化并行分离纯化,得到带Ｔ７和ｓｐ６启动子的ＤＮＡ片段和ＴＨ基因片段;经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后转入大肠杆菌,得到ｐＧＥＭＴＨ１重组克隆。经小量提取质粒井用酶切分析检测,证实其确有ＴＨ基因且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化则得到线状ＤＮＡ片段,用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶转录合成带有Ｄｉｇ标记的高比活度的单链ＲＮＡ探针;经斑点杂交试验证实该探针具有较高的可靠性。这将为基因治疗帕金森氏病动物模型的疗效检测提供有效手段。     

用Cox B3 cDNA探针检测不同病毒感染Hela细胞及小鼠心肌炎组织细胞中的肠道病毒RNA

本文用生物素标记柯萨奇B3病毒(Cox B3)cDNA(530bp)制备探针,检测不同病毒(Cox A9,Cox B1—B6,Polio1,ECHO1,AD3,HSV-1,HSV-2,VV)感染的Hela细胞,结果表明该探针只与肠道病毒核酸杂交而不与非肠道病毒核酸杂交,且可检测出Cox B3感染Hela细胞后3小时细胞病变阴性(CPE~-)细胞内的肠道病毒核酸,表明该探针具有良好的特异性和敏感性.同时用Cox B1感染BalB/c小鼠,建立小鼠心肌炎模型,取心肌组织与该探针进行原位杂交,成功地检测出心肌组织中的肠道病毒核酸.这对于用该探针检测人类病毒性心肌炎组织中的肠道病毒核酸,对病毒性心肌炎进行特异的早期诊断积累了经验.     

生物素标记的人IL-6受体基因探针的制备及在细胞原位杂交中的应用

制备了人IL-6受体cDNA 1.7 kb片段及其胞外区近膜侧区段0.5kb片段,分别用生物素标记制备了人IL-6受体基因探针,用斑点杂交分析了探针的灵敏度和特异性,并将探针用于四种白血病细胞系的原位杂交。结果表明,探针的灵敏度可达15～125pg/μl、特异性较好,所检测的四种细胞的IL-6受体mRNA表达水平与其细胞膜表面IL-6受体表达水平相一致。     

荧光原位杂交探针应用于平衡易位t（1，6）（q42；p23）胚胎植入前诊断的研究

背景：染色体相互易位在人群中比较常见,下一代常常产生相同或不同的易位,易导致容易流产,而植入前诊断方法之一的CGH难以检测到相互易位,因此原位杂交（FISH）依然是解决诊断相互易位的有力手段。目的：通过设计个体化的FISH探针,制备探针,并在卵裂球单细胞水平进一步验证探针的准确性,为筛选正常核型的囊胚进行植入奠定技术基础,为个体化的FISH探针植入前诊断提供应用研究基础。方法：通过设计1 q和6p平衡易位探针,进行探针标记,再采用患者和正常人核型验证探针质量,通过荧光原位杂交技术进一步检测正常人受精后的卵裂球中1q 和6p平衡易位对易位染色体状态。结果：3个卵接球裂均呈现单个完整细胞核,荧光原位杂交中各细胞核均有清晰明亮的杂交信号。信号数分别为2。均为正常胚胎,可以考虑进一步对该易位患者进行卵裂球进行诊断,上述研究对个体化的易位探针的应用研究提供了研究基础。     

人βNGFDNA地高辛标记探针的制备及在小鼠颌下腺中的基因表达

本研究在国内首先制备非放射性地高辛标记的人βＮＧＦＤＮＡ（ｄｉｇ－ｈ－βＮＧＦＤＮＡ）探针,并应用原位杂交技术结合计算机图像分析,对ＮＧＦｍＲＮＡ在ＩＣＲ雄性小鼠颌下腺中的分布进行了观察。实验结果显示ＮＧＦｍＲＮＡ主要分布于颌下腺纹状管（ＳＳＴ）和颗粒曲管（ＧＣＴ）的上皮细胞,其细胞基底部胞质呈杂交反应强阳性,细胞顶部呈弱阳性,图像分析显示二者具有显著性差异。本实验制备的ｄｉｇ－ｈ－βＮＧＦＤＮＡ探针灵敏度高达０．１ｐｇ／ｍｌ,并且特异性强,分辨力高,重复性好,是研究ＮＧＦｍＲＮＡ基因表达和调控的有力工具。     

14个染色体区带特异性探针池的构建

本文运用人类染色体显微切割和ＰＣＲ技术,成功地构建了１４个染色体区带特异性探针池,并通过染色体原位杂交证明它们均分别来源于相应的被切割的染色体区带。     

c-myc癌基因在大肠组织中表达的免疫组织化学和原位杂交研究

本文应用 c-myc 癌基因蛋白免疫组织化学和 mRNA 原位杂交方法研究了 c-myc 癌基因在大肠组织中的表达,并以胎盘作为阳性对照。发现在胎盘合体滋养叶细胞和结肠粘膜表面上皮都有 c-myc 癌基因的表达。结肠肿瘤 c-myc 表达增加,腺癌表达高于腺瘤。腺瘤中以绒毛状腺瘤表达最高。研究表明 c-myc 癌基因表达并不绝对与细胞增殖状态相关。